薛 瑩 , 范江霖, 劉恩岐

(1. 西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心, 西安 710061;2. 西安交通大學心血管研究中心, 西安 710061;3. 日本山梨大學醫(yī)學部分子病理學系, 日本山梨 409-3898)

家兔(Oryctolagus cuniculus)是最常用的實驗動物之一, 由于其體型大小適中、繁殖周期短、容易進行各種手術，因而被廣泛用于生物醫(yī)學研究[1]。家兔對高膽固醇飲食敏感，是第一個用于研究人類動脈粥樣硬化的動物模型[2]。由于心臟肌原纖維蛋白(sarcomeric protein)組成與人類相似，家兔也用于研究人類心肌疾病發(fā)病機理[3]。與其他體型較大的實驗動物(如，豬、犬、非人靈長類動物)相比，家兔價格低廉，而且容易培育成無特定病原體(SPF)和近交系家兔。另外，家兔在進化上比嚙齒類動物更接近人類[4]，家兔也有足夠血容量(100～150 mL/成年兔)來完成多個生化分析和反復測試[1]。

自1980年起，基因修飾(genetically modified,GM)動物研究和應用發(fā)展迅速。1985年，首例利用顯微注射技術制作成功轉基因家兔[5]。然而，直到1990年代，才開始使用轉基因家兔研究脂蛋白代謝、動脈粥樣硬化和肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)等，GM家兔人類疾病模型進入新時代[1]。

作為人類疾病動物模型，GM家兔顯得尤為珍貴。因為家兔是介于小型嚙齒動物類實驗動物(如，小鼠和大鼠)和大型哺乳動物(如，犬和家畜)之間的重要物種，不僅可以作為實驗動物模型來研究一些人類特定的疾病，而且可以作為生物反應器(bioreactor)生產(chǎn)用于實驗或醫(yī)藥工業(yè)的重組蛋白(recombinant proteins)[6]。

基于我們在GM家兔制作、應用研究中一些體會，本文將簡要描述GM家兔制作基本過程、討論GM家兔模型在生物醫(yī)學領域的應用價值，以期為大家介紹GM家兔作為人類疾病模型最新進展。

1 GM家兔培育歷史

GM動物是指對動物基因進行人為修飾并且這種修飾可以穩(wěn)定遺傳的一類動物品系，包括轉基因(transgenic)、基因敲除(knock-out, KO)、基因敲入(knock-in, KI)和敲低(knock-down)動物。

1980年，Gordon等利用DNA顯微注射技術培育了世界上第一個轉基因小鼠[7]。1985年，更大體型的轉基因哺乳動物(包括家兔、綿羊、豬)也被制作出來[5]。體型較大的轉基因動物具有特定的價值，不僅可以用作人類疾病動物模型，還可以作為生物反應器(如家兔、山羊、豬和牛)生產(chǎn)藥用重組蛋白[6]。1980年代后期，兩個實驗獨立地將一個突變體次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase)基因導入到小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞), 再將被修飾ES細胞注射到囊胚培育成功KO小鼠[8,9]。核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)是一種內(nèi)源性基因沉默機制, 通過雙鏈RNA序列介導mRNA降解原理，使用RNAi技術獲得ski基因敲低小鼠[10]，表型與KO小鼠類似，使得利用RNAi技術構建基因敲低家兔成為可能。近年來, 隨著鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription-activator like effector nucleases, TALENs)和RNA介導的規(guī)律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9等基因操作技術的誕生, 為培育新一代KO家兔模型提供了新契機。已經(jīng)證實, 利用ZFNs、TALENs技術、特別是CRISPR/Cas9基因組編輯技術培育KO家兔模型是可行的。如,Flisikowska等[11]采用ZFNs技術敲除了家兔IgM, 賴良學課題組[12,13]用ZFNs、TALENs技術分別敲除了家兔apoCIII、RAG 1和RAG 2基因, 建立了一個高效CRISPR/Cas9系統(tǒng), 同時敲除了家兔CD36、LDLR, RyR2和apoE等4個基因[14]。

1985年，世界上第一例轉基因家兔模型培育成功，該轉基因家兔表達人生長激素基因[5]。在開始培育GM家兔時，雖然蛋白質表達水平低、外源基因無功能或作用，但這些最初研究卻為利用GM家兔作為替代模型研究人類疾病(如, 代謝疾病、動脈粥樣硬化、HCM等)奠定了基礎[15]。

2 GM家兔模型建立

2.1 轉基因家兔

常規(guī)轉基因家兔培育方法包括顯微注射法、轉基因ES細胞囊胚注射法、基因轉移到精子和卵母細胞、轉染體細胞核移植以及病毒介導轉基因技術等, 這些方法在我們以前的文獻已有詳細闡述[1,16],這里不再贅述。DNA原核顯微注射是制作轉基因家兔最成功、也最常用方法。

利用顯微注射方法制作轉基因家兔與同樣方法制作轉基因小鼠過程相似，差異之處在于家兔受精卵直徑約為小鼠受精卵的2倍，但原核大小相似，家兔受精卵有一個厚厚的透明帶，家兔細胞核對外源DNA的純度似乎更敏感[1]。轉基因家兔培育不僅耗時, 而且受很多條件限制。首先, 外源DNA制備、供體胚胎產(chǎn)量、注射后胚胎存活率、妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)等都是非常重要影響因素, 這些因素容易人為控制和改進[17]。其次, 人們對轉基因家兔陽性率、嵌合體(mosaic)、外源基因不表達以及異位表達(ectopic expression)缺乏足夠的了解, 影響制作效率[18]。根據(jù)我們的經(jīng)驗, 通過原核顯微注射DNA培育轉基因家兔效率(轉基因仔兔數(shù)/總仔兔數(shù))在0.5%～5%[19-24]。也有人[25]提出雌、雄原核同時注射外源DNA可以增加轉基因兔的生產(chǎn)效率，但有待進一步驗證?？傮w來說，利用顯微注射方法制作轉基因家兔方法自誕生以來，沒有大的改進，對影響家兔轉基因效率的因素缺乏系統(tǒng)研究[1]。

“睡美人”(sleeping beauty, SB)轉座子(transposons)是第一個證明能夠在脊椎動物細胞中有效換位的轉座子, SB轉座子基因傳遞具有許多優(yōu)點,如，簡單、安全、廉價、受體基因永久插入，還可以轉更大、更復雜的外源基因。SB轉座子原核顯微注射法成為轉基因家兔構建的新方法[26]。

除了上述方法，也可通過精子介導法培育轉基因家兔[27-29]，逆轉錄病毒載體介導的轉基因方法也有報道[30]。精子和逆轉錄病毒載體介導的基因轉移似乎比顯微注射更容易、更有效，但是，這些技術僅僅被應用于方法驗證上，在人類疾病GM家兔模型建立和研究上還未見其應用。

2002年，利用體細胞核移植技術獲得第一只克隆家兔[31]，此后，李善剛等[32]也成功克隆了家兔，但克隆效率偏低，需要提高家兔核移植效率[33-35]，以利通過體細胞核移植培育轉基因和KO家兔[36-39]。

2.2 KO和KI家兔

1980年代初，由于ES細胞分離、培養(yǎng)成功，使得利用其制作KO動物模型成為可能。ES細胞來自囊胚內(nèi)細胞團，具有分化成各個組織的能力，但在體外可以保持不分化。根據(jù)同源重組的原理，利用分子生物學和組織培養(yǎng)技術可以定點敲除ES細胞中一個感興趣的基因，構建一個修飾后的ES細胞，然后將ES細胞注入早期胚胎的囊胚腔中，胚胎移植，可以獲得嵌合體子代動物。經(jīng)過修飾的ES細胞有可能分化成精子或卵子，修飾后的DNA則被傳遞到下一代[40]。1987年，KO小鼠培育成功[8]。小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等動物的ES或ES樣細胞已經(jīng)分離培養(yǎng)成功，然而，除了小鼠和大鼠外，目前還沒有其他物種ES細胞可以穩(wěn)定傳代的報告，因此，利用ES細胞打靶突變培育KO動物僅僅局限于小鼠。顯然, 依靠ES細胞獲得KO家兔是不可能的。1998年，科學家們發(fā)現(xiàn)在動物細胞內(nèi)存在一種基因表達調節(jié)機制，稱為RNAi (RNA interference)。利用RNAi技術已經(jīng)成功培育基因敲低小鼠模型[10]，因此利用該技術制作基因敲低家兔模型理論上也是可行的[41]。

近年來，一些新的、具有劃時代意義的DNA編輯工具出現(xiàn)，可以完全不依賴于ES細胞而實現(xiàn)基因特異性敲除。依靠特定核酸酶識別特定DNA序列，然后像“分子剪刀”(molecular scissors)一樣在動物基因組中產(chǎn)生高效的雙鏈斷裂(doublestrand breaks, DSB), 使靶基因功能性消失或用于基因組DNA序列特定位點的整合。ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9正是基于以上原理發(fā)展起來并帶來革命性變化的新技術[40,41]。

ZFNs由兩部分組成, 首先是3～6個Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成的DNA識別域, 另一部分是非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的催化結構域。通過DNA識別域識別特定DNA序列后將催化結構域定位到目標位點從而通過核酸內(nèi)切酶的作用切斷DNA形成雙鏈斷裂, 通過非同源末端連接(non homology end joining, NHEJ)進行基因突變[41]。Flisikowska 等[11]設計了兩對針對家兔IgM外顯子1和2的ZFNs, 并將構建好的ZFNs基因顯微注射到家兔受精卵原核，成功抑制了家兔IgM基因。Yang等[12]在研究中將ZFNs mRNA、家兔靶向apo-CIII基因注射于對家兔受精卵胞質中，發(fā)現(xiàn)ZFNs是產(chǎn)生KO家兔的有效方法。由于ZFNs采用較短的識別序列以及專利保護等導致ZFNs在靶序列選擇和應用上受到限制。將效應子蛋白與FokI核酸酶催化域融合表達產(chǎn)生TALENs，通過分別識別靶位點上下游序列兩條TALENs將其定位至特定基因靶位點，酶切產(chǎn)生DSB，誘發(fā)NHEJ導致基因插入或刪除突變，從而制作出KO動物，是TALENs技術基本原理[41]。Song等[13]設計了一對針對家兔RAG基因第1、2外顯子TALENs, 通過胚胎顯微注射TALENs mRNA，成功地獲得RAG KO家兔模型。CRISPR位點是由一串連續(xù)排列的短指向性重復序列中間夾雜一些短間隔序列(spacer), CRISPR通過產(chǎn)生RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA)與CRISPR-associated protein(CRISPR/Cas9)相結合形成識別催化結構，可識別基因組特定DNA序列并切除?；贑RISPR/Cas9原理，研究者們設計了一套用于GM編輯的工具，利用single guide RNA(sgRNA)代替互補的crRNA，與Cas9一起發(fā)揮作用產(chǎn)生DSB。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究者已經(jīng)成功在多種哺乳動物(包括非人靈長類)中實現(xiàn)了基因突變, 在Cas9和gRNA共同作用下成功誘導特異性DNA識別、產(chǎn)生DSB、誘導NHEJ發(fā)生[41]。Yang等[14]利用該技術同時敲除4個基因位點(CD36，LDLR，RyR2，apoE)，是使用CRISPR/Cas9構建KO家兔的第一例成功報道。

CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs在制作KO動物效率上差距并不明顯，但CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)更加簡單、高效，成為動物基因編輯最常用工具，而ZFNs和TALENs鮮有應用[40]。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)雖然提高了KO及定點修飾(如，定點突變、基因插入)的效率, 但是基于同源重組機制的基因定點突變效率仍然較低。2016 年, Komor等[42]報告了一種新的單堿基編輯系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)可以在不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的情況下，利用sgRNA將 Cas9-胞嘧啶脫氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者構成的融合蛋白，sgRNA 通過與靶位點互補配對，引導融合蛋白結合到靶位點發(fā)揮作用。融合蛋白中的胞嘧啶脫氨酶能夠使非互補鏈中相應的胞嘧啶C經(jīng)脫氨基作用轉變?yōu)槟蜞奏，而 DNA復制進一步使得U被T代替，而互補鏈上原來與C互補的堿基鳥嘌呤G將會變成腺嘌呤A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子則能夠抑制U的切除，最終實現(xiàn)非互補鏈上的C替換為T和互補鏈上G替換為A的精確編輯?；谠摷夹g，賴良學團隊[43]建立了一個高效單堿基編輯系統(tǒng)，在國際上率先在家兔上改變單個堿基, 精確地模擬出人類單堿基突變遺傳病中的無義突變、錯義突變和RNA錯誤剪切, 成功培育出白化病、早衰癥、雙肌臀等疾病模型兔。

很顯然，得益于新近發(fā)展的DNA編輯技術(特別是CRISPR/Cas9)，不依靠ES細胞也可以輕易制作KO、KI家兔模型，用于生物醫(yī)學研究。可以預見，在不久的將來，依靠這些新技術，組織特異性KO家兔模型也將培育成功，大大豐富GM家兔模型資源。

3 GM家兔在心血管研究中應用

采用我們曾經(jīng)使用的檢索策略[15], 我們發(fā)現(xiàn)從1985年開始, 每年發(fā)表的GM家兔相關論文數(shù)量一直在增加, 上世紀末、本世紀初達到高峰, 近年來略有下降(圖1)。GM家兔主要應用領域集中在生化分子生物學和心血管系統(tǒng)(圖2)。下面簡要介紹一下在GM家兔作為人類疾病動物模型的研究進展。

圖1 不同年齡GM家兔相關論文數(shù)量

因為KO、KI家兔模型培育成功歷史相對較短，目前GM家兔在生物醫(yī)學研究中應用成果大多數(shù)來自轉基因家兔模型。

全世界每年死亡人數(shù)的30%是由于心血管疾病(cardiovascular vascular disease, CVD)，我國CVD病死亡率更是世界平均水平的1.5倍，是危害人類健康名副其實的第一殺手[44]。CVD病理基礎是動脈粥樣硬化，脂代謝異常可引起動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展[45]。因此，研究動脈粥樣硬化、脂代謝對預防和治療人類CVD有重要意義。

3.1 脂代謝和動脈粥樣硬化

利用轉基因家兔模型開展人類相關疾病研究起始于1994年，F(xiàn)an等[47]報道了家兔過表達人肝酯酶(hepatic lipase, HL)影響血脂和動脈粥樣硬化以來，過表達人類15-lipoxyenase、ABCG 1、apo(a)、apoA-I、apoA-II、apoB-100、apoC-III、apoE2、apoE3、CETP、CRP、LCAT、LPL、MMP-12、PLTP、VEGF、U-II以及過表達家兔apoB mRNA編輯蛋白等基因的轉基因家兔模型相繼培育成功。通過雜交育種技術, 已成功將人類apo(a)、LCAT、LPL、MMP-12等基因轉移到低密度脂蛋白(LDL)受體缺陷的家族性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL)家兔背景下。此外，雙表達人HL和apoE、apo(a)和apoB、HL和apoB基因的雙轉基因家兔及同時表達apoA-I/C-III/A-IV的3個基因轉基因家兔模型也培育成功，用于研究這些基因在人類脂質代謝和動脈粥樣硬化疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用。

圖2 GM家兔不同應用領域論文數(shù)量

轉基因家兔模型在解析以上基因在脂代謝和動脈粥樣硬化作用做出了重要貢獻，由于篇幅限制，具體每個GM家兔貢獻和相應文獻可參照我們已發(fā)表相關綜述[1,46,47]。

3.2 心臟病

在心臟病研究方面，兩個研究小組[48,49]分別構建轉基因家兔模型來研究心血管生理、模擬HCM。其中一個研究小組構建了β肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, MyHC)缺陷的轉基因兔模型，發(fā)現(xiàn)其表型與表達人類MyHC突變型患者幾乎相同：心肌肥大、肌細胞和肌原纖維排列紊亂、間質纖維化、過早死亡。MyHC轉基因家兔模型也被用來評價藥物對HCM和心肌纖維化影響[48,50-54]。另一個小組的James等使用小鼠α和β MyHC作為啟動子、制作了過表達肌球蛋白輕鏈突變體(m149v)的轉基因家兔, 來探討這種突變與HCM關系[49,55]。最近，該研究小組[55-60]還構建了在心室表達心肌肌鈣蛋白I(cTnI-146Gly)、α-MyHC、心臟G蛋白α(GSα)等轉基因家兔模型研究人類心臟衰竭。cTnI-146Gly轉基因家兔再現(xiàn)了人HCM表型[56]，α-MyHC轉基因家兔肌原纖維蛋白異樣[57,58]，GSα轉基因家兔心率加快、收縮增強[59,60]。此外，Brunner等[61-63]成功構建表達人類鉀通道突變基因KCNQ1和KCNH2轉基因家兔，表現(xiàn)長心室復極延長(QT)綜合征表型。

3.3 其它領域

除了CVD以外，GM家兔在免疫學研究中也有重要應用。如，家兔對HIV-1感染敏感、但進程緩慢，主要是由于人類和家兔CD4結合位點的病毒蛋白HIV gp20不同，有鑒于此，兩個實驗室建立了表達人CD4轉基因家兔模型，發(fā)現(xiàn)來源于CD4轉基因家兔淋巴細胞感染HIV-1后容易凋亡，表明用轉基因家兔模型研究HIV可行[64-66]。此外，基于新一代基因編輯技術，免疫缺陷家兔模型也已經(jīng)培育成功[4]，拓展了GM家兔模型在免疫、腫瘤等的應用，也為未來人類腫瘤預防、診斷和治療提供了獨特的模型。

從圖2可以看出，GM家兔模型在生物醫(yī)學研究中應用極其廣泛，這里不再贅述。另外，轉基因家兔模型可以成為生物反應器，生產(chǎn)實驗或醫(yī)藥工業(yè)用重組蛋白，家兔具有小動物(小鼠、大鼠)和大動物(山羊、綿羊、牛)無法比擬的優(yōu)越性，該領域不屬于人類疾病動物模型范疇，故這里也不作詳細討論，有興趣讀者可閱讀我們相關綜述[6]。

4 家兔與小鼠

家兔脂蛋白代謝和心血管特性與人類相似，而與生物醫(yī)學研究中使用最廣泛的小鼠模型不同：①家兔與人類脂蛋白譜(低密度脂蛋白豐富)相似，與小鼠(高密度脂蛋白豐富)不同; ②家兔的肝臟不能編碼apoB48 mRNA，像人的肝臟一樣只能合成apoB2100，而小鼠肝臟既能產(chǎn)生apoB2100, 又可以合成apoB48。因此，小鼠的apoB48既存在于肝源性極低密度脂蛋白中, 也存在于腸源性乳糜微粒之中，而人類的apoB48只存在于人的乳糜微粒之中;③家兔與人類血漿中有豐富膽固醇脂轉運蛋白，而小鼠缺乏固醇脂轉運蛋白; ④膽固醇飲食可以容易誘導家兔動脈粥樣硬化，而大多數(shù)小鼠品系對此抵抗; ⑤與小鼠相比，家兔缺乏與人相似的apoA-II且具有較低的HL的活性[41,46]。家兔與小鼠的以上差異，暗示在研究脂蛋白代謝與動脈粥樣硬化方面，家兔是一個獨特的動物模型。

家兔也是心臟病研究獨特的模型： ①與小鼠相比, 家兔心臟體積較大和心率緩慢，更利于清醒狀態(tài)下的生理分析(如, 超聲、心臟導管插入); ②人類和家兔間肌原纖維蛋白的相似性高。如, β-MyHC蛋白是人和家兔心室肌細胞主要亞型，超過肌原纖維中肌球蛋白總數(shù)80%，而α-MyHC是小鼠亞型，超過95%; ③與家兔和人類心臟相比, 小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的正收縮-頻率關系(positive force-frequency relationship); ④家兔β腎上腺素能受體信號轉導途徑的分子變化與人類心衰患者相似[40,41]。

動物物種間表型差異、同種動物個體差異受遺傳背景和環(huán)境因素雙重影響。即使同一GM的家兔和小鼠模型，因其遺傳背景不同，表型也可能不同。如，過表達人LCAT家兔具有抗動脈粥樣硬化作用、而在小鼠卻促進動脈粥樣硬化[67,68]; 轉基因小鼠LPL高表達引起肌病(myopathies)，家兔則不出現(xiàn)疾病[69,70]; ctTnI-146Gly轉基因家兔心肌肥厚，轉基因小鼠卻不出現(xiàn)心肌肥厚[56,71]?？赡苁怯捎诩彝弥鞍状x、心血管特性與小鼠不同，基因導入后可能產(chǎn)生不同甚至完全相反的表型。因此，對于研究諸如動脈粥樣硬化、心臟衰竭、HCM、肥胖、糖尿病等復雜的疾病發(fā)病機理，尋找預防或治療策略時，家兔模型可能是小鼠模型重要補充，因為家兔模型可能更近似于人類復雜的生理狀況(如，脂代謝和心血管特征)。再如, 我們知道心血管疾病的病理基礎是動脈粥樣硬化，而動脈粥樣硬化是一個慢性炎癥過程[45]。最新研究[72]表明，小鼠炎癥反應過程與人類不同，提示單純使用小鼠模型研究人類炎癥性疾病可能有缺陷。也許，家兔模型正好可以彌補這個缺陷。

當然，GM家兔模型制作和應用也有一些不足之處(主要是家兔這個物種本身造成)，如，SPF和近交系家兔模型不常見、沒有廣泛使用; 構建和維持GM家兔需要更高成本; 解析GM家兔模型表型需要花費更長時間; 條件性KO家兔和“工具”家兔制作和維持成本高；缺乏種類足夠多抗體用于組織學和分子生物學研究；缺乏精細家兔基因組序列信息(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/316?genome_assembly_id=203429）。還有，家兔是草食性動物，食性特征與人不一致; 高脂飼料誘導和WHHL等家兔動脈粥樣硬化發(fā)生部位與人不一致[73];誘導家兔心肌梗死和腦梗模型困難; 等等，限制了家兔或GM家兔模型在生物醫(yī)學研究中廣泛使用。

5 展望

GM家兔在研究人類疾病發(fā)生和發(fā)展過程中有獨特的、小鼠無法替代的作用，特別是在研究人類諸如高脂血癥、動脈粥樣硬化、心臟病、免疫學、腫瘤等復雜疾病方面，GM家兔模型為探討其發(fā)病的分子機制開辟了新的途徑。經(jīng)過20多年的發(fā)展，GM家兔為我們認識許多人類疾病做出了寶貴的貢獻。

動物轉基因技術的一個重大缺陷是外源基因整合位點的隨機性, 相對于轉基因技術而言, 基因打靶(包括KO、KI和基因敲低)是研究基因功能更強大的手段。隨著ZFNs、TALENs, 特別是CRISPR/Cas9等新的基因編輯技術的出現(xiàn), 給家兔基因打靶帶來了重大突破。隨著這些新技術不斷改進和優(yōu)化, 更多、更新、更精確的GM基因家兔模型將會產(chǎn)生。不編碼蛋白質的小RNA(microRNA, miRNA)，或是長非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)也將被引入到GM家兔研究中，培育miRNA或lncRNA KO或KI家兔將成為可能。此外，使用新GM技術可以建立擬人化家兔模型，將會使對人類疾病的研究更加深入。我們相信，未來GM家兔將成為生物醫(yī)學研究不可或缺的動物模型，必將為研究人類疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制、尋找切實可行預防、診斷和治療措施提供幫助。