李佳瑤，周 珺，王 媛，溫宇嬋，趙寶頂，張 怡

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

柑橘是世界第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。目前，全國(guó)每年產(chǎn)生的柑橘皮渣在千萬(wàn)噸以上[1]，對(duì)柑橘皮渣的處理已成為各食品加工企業(yè)的重大難題。柑橘皮渣含有豐富的碳水化合物、脂肪、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，可以作為微生物發(fā)酵的基質(zhì)。同時(shí)，柑橘皮渣中含有大量的纖維素、木質(zhì)素和果膠類(lèi)等生物大分子物質(zhì)[2]，經(jīng)過(guò)處理可將其降解為微生物可利用的小分子物質(zhì)，生產(chǎn)附加值高的單細(xì)胞蛋白新飼料。固體發(fā)酵作為一種發(fā)酵方法，過(guò)程容易控制、能耗低、操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵產(chǎn)物高、對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求相對(duì)低、不易發(fā)生大面積污染。本實(shí)驗(yàn)以柑橘皮為原料，通過(guò)測(cè)定已降解粗纖維和生成蛋白質(zhì)含量，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在保證蛋白質(zhì)含量較高的前提下，選取粗纖維降解率較大的生產(chǎn)工藝。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)器材

粉碎機(jī)、電爐、凱氏定氮儀、冷凝管、真空泵、烘箱、電阻爐、干燥器。

1.1.2 試劑

0.882 mol/L氫氧化鈉、3.5mL硫酸、無(wú)水乙醇、40%氫氧化鈉溶液、2%硼酸、25%氫氧化鈉溶液、10%硫酸銅溶液、0.1%甲基紅、0.1%溴甲酚綠、大約0.1mol/L鹽酸、尿素、硫酸銨、2g/100mL磷酸二氫鉀、0.25g/100mL硫酸鎂。

1.1.3 菌種

混合菌種(綠色木霉、康寧木霉、枯草芽孢桿菌)通過(guò)淘寶網(wǎng)購(gòu)自蘇柯漢生物酶制劑。

1.2 制備柑橘皮渣

將柑橘剝?nèi)⊥馄?，洗凈、烘干、粉碎成末，即得到柑橘皮渣?/p>

1.3 正交培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)

以柑橘皮渣 9g和麩皮 1g為發(fā)酵底物，加入混合菌種0.1g，利用4水平 5因素正交試驗(yàn)，對(duì)尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水的添加量進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)溫度為 30℃，培養(yǎng)時(shí)間為 72h。通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)和已降解粗纖維，篩選最佳培養(yǎng)基配方，確定最佳工藝。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experiment design

1.4 采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

稱(chēng)取 10g固體發(fā)酵后樣品置于燒杯中加水，水沸騰后計(jì)時(shí)，30min后立即依次加入適量的氫氧化鈉和硫酸銅溶液，沉淀靜置 2h以上或過(guò)夜；溶液中沉淀用濾紙抽濾，溫水洗滌 5～6次直至檢驗(yàn)無(wú)硫酸根離子為止，沉淀連同濾紙放入 75℃干燥箱中干燥60min。將消化管潤(rùn)洗后放入 25℃干燥箱中烘干；將沉淀物放入消化管中，加入催化劑和 15mL硫酸在通風(fēng)櫥中消化 1～1.5h，消化管中顏色變至淺黃色后加 5～6滴水，再消化 0.5h，當(dāng)顏色為淺藍(lán)色或接近無(wú)色時(shí)取出冷卻。測(cè)定空白體積，再滴定樣品，向消化管中加入鹽酸、水、氫氧化鈉、硼酸和指示劑，以溶液顏色由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色為終點(diǎn)。將儀器按說(shuō)明書(shū)清洗，測(cè)試儀器穩(wěn)定性 2～3次，所得滴定數(shù)據(jù)極差不超過(guò)0.05，所得滴定體積即為測(cè)定蛋白質(zhì)空白體積[3-4]。此外測(cè)定空白體積一次。

1.5 采用酸堿法測(cè)量纖維素含量

將 1.734g固體發(fā)酵后樣品和 200mL煮沸的硫酸進(jìn)行回流，加熱使之微沸并經(jīng)過(guò) 30min后樣品質(zhì)量記作 W(g)。在圓底燒瓶中加入 200mL煮沸的氫氧化鉀溶液，加熱沸騰后回流 30min，取濾紙?jiān)?05℃下烘10min稱(chēng)重記作W0(g)。將圓底燒瓶中所有溶液抽濾，再用熱蒸餾水充分洗滌至中性后加入60℃無(wú)水乙醇 25mL，然后洗滌、再抽濾。將濾紙及濾紙上的殘留物放入坩堝中，將坩堝和內(nèi)容物置于130℃的烘箱中烘 120min至恒重，立即閉蓋并放入干燥器中 30min，即得殘留物，稱(chēng)重記作 W1(g)。將坩堝放在電爐上加入直至無(wú)煙拿出。將炭化的坩堝放入電阻爐中，電阻爐溫度大約為550℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)30min，灼燒至恒重，取出將其放入干燥器中30min，稱(chēng)重記作W2(g)[5-6]。

計(jì)算：已降解的纖維素百分含量=100%-(W1-W2-W0)/W×100%

式中：W 為樣品初始質(zhì)量；W0為烘干后濾紙的質(zhì)量；W1為坩堝和內(nèi)容物烘干后的質(zhì)量；W2為坩堝和內(nèi)容物灰化后的質(zhì)量。

1.6 最佳配方重復(fù)

柑橘皮中已降解粗纖維和蛋白質(zhì)含量測(cè)定后，使用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)正交試驗(yàn)，得出最佳結(jié)果，選出最佳培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘皮固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)產(chǎn)蛋白含量

采用正交試驗(yàn)方法，進(jìn)行不同配方的發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表2。

表2 蛋白質(zhì)含量Tab.2 Protein content

續(xù)表2

從 R值可知，影響正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素依次為A＞B＞D＞E＞C，即影響降解纖維素的因素依次為尿素＞硫酸銨＞硫酸鎂＞水＞KH2PO4。從 K值可知，在 A4B4C3D4E3的配方下，蛋白質(zhì)有較高產(chǎn)量。從相關(guān)系數(shù)可知，尿素、硫酸銨、硫酸鎂、水呈現(xiàn)正相關(guān)，磷酸二氫鉀呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

2.2 柑橘皮固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)已降解粗纖維

從 R值可知，影響正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素依次為C'＞E'＞A'＞D'＞B'，即影響降解纖維素的因素依次為KH2PO4＞水＞尿素＞硫酸鎂＞硫酸銨。從K值可知，在 A'1B'2C'4D'1E'1的配方下，纖維素的降解程度最大。從相關(guān)系數(shù)可知，硫酸銨和磷酸二氫鉀呈現(xiàn)正相關(guān)，尿素、硫酸鎂和水呈負(fù)相關(guān)(表3)。

2.3 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果與分析

結(jié)合以上兩組相關(guān)性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)中硫酸銨均為正相關(guān)。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)以生成的蛋白質(zhì)含量為最終目標(biāo)，所以觀測(cè)指標(biāo)是以生成的蛋白質(zhì)含量為主。在表1中，尿素、硫酸鎂、水呈現(xiàn)正相關(guān)；表2中，硫酸二氫鉀呈現(xiàn)正相關(guān)。綜合上述相關(guān)性結(jié)論分析，最佳配方為0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g磷酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和14mL水。

取上述最佳配方進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)：以柑橘皮渣 9g和麩皮 1g為發(fā)酵底物，加入混合菌種 0.1g，在含0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g硫酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和 14mL水的培養(yǎng)基 30℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)完成后，測(cè)定蛋白質(zhì)含量和已降解纖維素，結(jié)果如表4。

由表4可知，此次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中生成蛋白質(zhì)含量和已降解的纖維素雖沒(méi)有高于正交試驗(yàn)中最大值，但也處于相對(duì)較高的水平。結(jié)合上述相關(guān)性分析，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)性分析結(jié)論相符，所以?xún)?yōu)化后配方在保證蛋白質(zhì)產(chǎn)量的基礎(chǔ)上更大程度地降解了纖維素，初步判斷此配方適用。

表3 已降解的粗纖維Tab.3 Degraded crude fiber

表4 最佳配方重復(fù)實(shí)驗(yàn)Tab.4 Results of repeated experiments

3 討論與結(jié)論

①在接種的時(shí)候一定要將菌種均勻地接入到固體培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基中菌體活動(dòng)能力沒(méi)有在液體培養(yǎng)基中強(qiáng)，接種不均勻可能導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不一，獲得營(yíng)養(yǎng)成分不等之類(lèi)問(wèn)題，會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)影響。而且，固體發(fā)酵底料要妥善保存，避免染菌變質(zhì)導(dǎo)致其中營(yíng)養(yǎng)被消耗。

②綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，混合菌種(綠色木霉、康寧木霉、枯草芽孢桿菌)在 30℃的條件下，以柑橘皮為主要原料，0.15g尿素、0.3g硫酸銨、0.06g硫酸二氫鉀、0.0075g硫酸鎂和 14mL水的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h，可在保證蛋白質(zhì)高產(chǎn)量的基礎(chǔ)上更大程度地降解纖維素。