王玉梅 褚光輝 付玉（通訊作者）

（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院 云南 昆明 650000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer Disease，AD）是一種最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和神經(jīng)精神異常，AD的病理學(xué)改變包括：神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和細(xì)胞外的β淀粉樣蛋白沉積等[1-2]。阿爾茨海默病的病因尚未完全明了，其發(fā)病機(jī)制的研究一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，Aβ假說(shuō)[3]因其能夠較好的符合病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)以及臨床流行病學(xué)研究結(jié)果而受到越來(lái)越多的認(rèn)可。

針對(duì)Aβ假說(shuō)，目前構(gòu)建了多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠被認(rèn)為是最能夠模擬AD自然病理生理過(guò)程的動(dòng)物模型[4]。轉(zhuǎn)基因鼠價(jià)格較高，為節(jié)約成本并使本課題有充足的AD模型，我們使用APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因純合子雄鼠和野生型雌鼠進(jìn)行繁殖，采用Vazyme公司的試劑盒快速提取鼠尾基因組，采用多引物多重PCR進(jìn)行子代小鼠基因型鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確快速。具體方法及結(jié)果如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

由南京模式動(dòng)物研究所提供B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax雙轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性雄鼠10只，野生陰性雌鼠10只（5～6月齡）。雌雄分開(kāi)每5只一組飼養(yǎng)于昆明理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)間。飼養(yǎng)期間遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（22±2）℃ ，濕度：50%～70%，光周期L：D=12h：12h，自由飲水和取食。雄鼠體重28～32g，雌鼠體重23～26g。

1.2 主要試劑和儀器

One Step Mouse Genetyping Kit試劑盒（Vazyme公司）。APP、PSl引物（上海生工）。Genecolour Ⅱ TM核酸染料（北京金博益）。PCR儀（Biometra公司），凝膠電泳成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），低速臺(tái)式離心機(jī)（Sigma公司），電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.3 繁殖方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)一月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雄鼠與雌鼠一對(duì)一進(jìn)行交配繁殖。子代小鼠出生28天后雌雄分籠飼養(yǎng)并打耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記。

1.4 基因鑒定

1.4.1 鼠尾獲取 小鼠出生28天后剪取尾尖2～3mm備用。

1.4.2 DNA提取 （1）根據(jù)樣品數(shù)按每個(gè)樣品2μl蛋白酶K+100μl緩沖液配制裂解液；（2）每個(gè)EP管加入100μl裂解液確保鼠尾完全浸入，混勻，55℃金屬浴20min；孵育完成后95℃金屬浴5min滅活蛋白酶K；（3）裂解產(chǎn)物振蕩混勻，12000rpm，離心5min。取上清液，-20℃保存。

1.4.3 PCR擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)如下 APP（350bp）正 義 鏈：5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'； 反 義鏈：5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCC-3'。PSl（608bp）正 義 鏈：5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'； 反 義 鏈：5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'。GAPDH（224bp） 正義 鏈：5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'， 反 義 鏈：5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'。PCR反應(yīng)體系25uL，同時(shí)加入三對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，63℃退火40s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行光密度掃描，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。

2.結(jié)果

2.1 小鼠繁殖數(shù)量

初始繁殖籠10籠，淘汰無(wú)法生育，吃崽及不哺乳小鼠后剩余6籠為可繁殖籠。每籠平均約每月繁殖一窩，每次產(chǎn)仔4～6只。合籠3個(gè)月后子代小鼠存活狀況及基因鑒定結(jié)果如表1所示。

表 合籠三個(gè)月后子代小鼠的總數(shù)及基因型

AD為APP/PSl雙轉(zhuǎn)基陽(yáng)性鼠，WT為野生同窩陰性鼠。表中數(shù)據(jù)為合籠三個(gè)月后子代成活小鼠數(shù)量。

2.2 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因子代小鼠基因型的鑒定

以鼠尾組織基因組DNA為模板，鑒定電泳結(jié)果如圖。5只小鼠的三引物體系均擴(kuò)增出約200bp的內(nèi)參基因，其中2、4、5號(hào)3只小鼠同時(shí)擴(kuò)增出約350bp和600bp左右的條帶，與APP和PS1基因大小相符。對(duì)比APP和PS1雙引物體系的擴(kuò)增結(jié)果，說(shuō)明在合適的PCR條件下三引物體系可以準(zhǔn)確有效鑒定出APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因子代小鼠的基因型。

圖 APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的多引物PCR鑒定結(jié)果

M為DL2501 DNA Marker，2、4、5是雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠，1、3是雙轉(zhuǎn)基因陰性鼠。

3.討論

本實(shí)驗(yàn)采用APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因純合子雄鼠與野生同窩陰性雌鼠交配繁殖，根據(jù)遺傳規(guī)律后代有1/4的機(jī)率為陰性純合子，所以在使用前必須進(jìn)行基因型檢測(cè)。目前大多采用單引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，鑒定過(guò)程較長(zhǎng)且耗費(fèi)較多的DNA樣本及試劑。該實(shí)驗(yàn)使用Vazyme公司One Step Mouse Genetyping Kit試劑盒快速提取組織DNA，且裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后不需其他處理即可直接用做PCR擴(kuò)增模板。采用多對(duì)引物法同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的鑒定結(jié)果與雙引物法相同，但極大的節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，為課題組今后開(kāi)展AD相關(guān)研究提供了理想的動(dòng)物模型。