鄭慶霞，劉萍萍，陳 霞，王 冰，翟 妞，陳千思，金立鋒，路 鑫，徐國云，張 慧，許國旺，周會娜*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧省大連市中山路457號 116023

煙葉化學成分與感官品質(zhì)［1-6］、燃燒特性［7］等緊密相關，其直接或間接來自鮮煙葉中積累的代謝物質(zhì)，如鮮煙葉中的質(zhì)體色素［8-9］、多酚類物質(zhì)［10-11］、游離氨基酸［12-16］等與烤后煙葉的外觀質(zhì)量、評吸質(zhì)量以及致香成分質(zhì)量分數(shù)等緊密相關。盡管通過農(nóng)藝栽培措施、常規(guī)育種、基因調(diào)控等手段影響鮮煙葉中的代謝物質(zhì)從而實現(xiàn)對煙葉品質(zhì)的調(diào)控一直是煙草農(nóng)業(yè)的研究熱點，但進展較為緩慢，其原因可能在于烤后煙葉化學成分的形成是鮮煙葉全部代謝物質(zhì)經(jīng)過調(diào)制后的綜合表現(xiàn)，而目前研究的側(cè)重點則局限于較少的一部分代謝物，且缺乏對這些代謝物在烤后煙葉化學形成過程中的作用與貢獻的綜合評價與系統(tǒng)認識。因此為了進一步擴展對鮮煙葉代謝物的認識，衡量鮮煙葉代謝物質(zhì)對烤后煙葉化學成分、感官品質(zhì)等形成的影響，有必要在組學水平上開展鮮煙葉的代謝物質(zhì)研究。

作為組學技術之一，代謝組學技術可對生物體、組織、細胞等體系內(nèi)的小分子物質(zhì)（小于1 500 Da）進行較為系統(tǒng)和全面的分析。當前，代謝組學技術在農(nóng)作物育種［17-19］、轉(zhuǎn)基因效應評價［20-21］、生物脅迫與非生物脅迫［22-23］等研究中的應用日趨廣泛［24］。煙草代謝組學技術平臺在中國煙草基因組重大專項第一個五年計劃期間就已經(jīng)建成并運行，而隨著第二個五年計劃的實施及功能基因研究的全面展開，代謝組技術在評價鮮煙葉內(nèi)在變化、快速篩選編輯煙株及評估分析基因功能等方面的應用需求迫在眉睫；同時隨著多家單位合作的深入，也對不同單位產(chǎn)生數(shù)據(jù)的一致性和可比性提出了更高的要求。因此有必要對煙草代謝組學研究從樣品采集到數(shù)據(jù)分析建立統(tǒng)一的操作流程，以便于進一步普及煙草代謝組學研究技術，加快煙草基因研究和精準育種進程。

在代謝組學研究中，往往采用多種檢測方法以期盡可能地彌補單一檢測技術對代謝物檢測的局限性和偏向性［25］，目前較多采用的代謝組檢測技術有 NMR［26］、GC-MS［27］和 LC-MS［28］等。在醫(yī)學代謝組學中已經(jīng)有比較全面的代謝組學檢測方法［29-30］可以參照，在植物代謝組學領域尤其是煙草代謝組學研究方面尚沒有一個統(tǒng)一可供參考的代謝組學檢測流程。因此，基于煙草代謝組學的特殊性及儀器的普及性和可操作性，本研究中建立了基于GC-MS和LC-MS技術的煙草鮮煙葉代謝組學檢測分析流程，方法涵蓋煙葉中常見的初生及次生代謝產(chǎn)物500余種，旨在促進煙草代謝組學的推廣及應用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2014年分別在云南祥云、貴州遵義和河南襄縣三地同時種植紅花大金元、中煙100和K326，采集其旺長期、現(xiàn)蕾期、盛花期、下部葉成熟期、中部葉成熟期前、中部葉成熟期6個生育期第十葉位煙葉后，迅速用帶有編號的錫箔紙包裹后在液氮中速凍，10 min后轉(zhuǎn)移并包埋于裝有足量干冰的加厚泡沫箱中，快速運至實驗室。在實驗室中開箱檢查后，將尚有充足干冰余存且冷凍狀態(tài)保持較好的樣品于-80℃超低溫冰箱中保存。

甲酸、乙腈、無水乙醇、正己烷、氯仿、甲醇、異丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸（色譜純，美國Merck、Fisher、J T Baker公司）；丙酮、甲酸銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、三乙胺（AR，上海麥克林生物科技有限公司）。衍生化試劑MSTFA［N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺］和BSTFA［N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺］（＞99.0%，美國Sigma Aldrich公司）。各標準品分別購自美國Sigma-Aldrich、Chromadex、Acros Organics公司和加拿大TRC公司等。

BSA2245-CW型電子分析天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；K20Nx型恒溫培養(yǎng)振蕩器（杭州博日科技有限公司）；5424型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；25EL型真空冷凍干燥機（美國Virtis公司）；N-EVAPTM112型氮吹儀（美國Organomation公司）；MJ-35BE01A型攪拌機（美的集團有限公司）；1260型高效液相色譜儀、7890/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀、1290/6540型液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；Thermo TRACE 1300/TSQ8000型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、SPD111V型真空濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Acquity UPLC-SQD型液相色譜-單四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉樣品處理

從超低溫冰箱中取出煙葉冷凍樣品，在液氮冷卻下初步粉碎、混勻，分為兩部分：一部分作為冷凍鮮煙葉樣品繼續(xù)于-80℃保存，使用前于研缽中在液氮冷卻下研磨成粉末；另一部分煙葉樣品經(jīng)真空冷凍干燥后放入攪拌機中粉碎成粉末狀，裝入50 mL離心管中密封，于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 煙葉代謝組檢測

為了盡可能多地檢測出鮮煙葉中的代謝物，除了使用液相色譜對植物色素進行檢測外，文獻及本研究中基于LC-MS和GC-MS技術建立了針對不同極性、不同物質(zhì)種類的多種檢測方法，如表1所示。其中靶向檢測方法5項，非靶向檢測方法3項，這些方法中，方法2（多酚/類黃酮檢測）、方法3（脂類檢測）、方法6（萜類檢測）、方法8（非靶向GC-MS檢測）相關文獻［31-34］中已有詳細描述，以下主要對其他4種方法進行描述。

1.2.2.1 煙葉樣品中的色素測定

冷凍鮮煙葉樣品和凍干鮮煙葉樣品色素的質(zhì)量分數(shù)按照 YC/T 382—2010［31］的方法測定。

1.2.2.2 基于LC-MS平臺的煙葉代謝組檢測

方法1-游離氨基酸：準確稱取凍干煙葉粉末35 mg于2 mL離心管中，加入2 mL提取液（70%的乙醇，含內(nèi)標正纈氨酸，濃度為5 mg/L）；置于搖床中，160 r/min、25 ℃，提取1 h，提取液3 000 r/min離心15 min后，再用0.22 μm水相濾膜過濾；采用Waters AccQ-Tag derivation kit試劑盒進行衍生，之后按照李好麗等［36］的方法進行色譜-質(zhì)譜分析。

表1 基于LC-MS和GC-MS技術的煙草代謝組學檢測方法Tab.1 Analysis methods for tobacco metabolomics based on LC-MS and GC-MS

方法4-基于LC-MS平臺的非靶向分析：準確稱取20 mg凍干煙葉粉末于2 mL離心管中，加入1.5 mL提取液（75%的甲醇，含內(nèi)標傘形花內(nèi)酯，濃度為2.5 mg/L），室溫超聲提取60 min，提取液12 000 r/min離心15 min；取上清液1 mL轉(zhuǎn)移到2 mL樣品瓶中，進行色譜-質(zhì)譜分析。分析條件：

色譜柱：Agilent-Zorbax SB C18柱（2.1 mm×100 mm，填充物粒徑1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；線性洗脫程序：2 min內(nèi)流動相B的體積分數(shù)從15%上升至30%，2～10 min從 30%上升至 85%，10～15 min從85%上升至90%，17 min后上升至100%并保持3 min，然后回到初始比例，平衡4 min；流速：0.3 mL/min；柱溫：60℃；檢測波長：200～400 nm。檢測模式：正離子模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12 L/min；噴霧器壓力：275.6 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：10 L/min；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：480 V；錐孔電壓：65 V；碎裂電壓：130 V；八極桿射頻電壓：750 V；質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 000 Da。

1.2.2.3基于GC-MS平臺的煙葉代謝組檢測

方法5-生物堿：準確稱取150 mg凍干煙葉粉末于15 mL螺口耐壓試管中，加入1.75 mL 5%氫氧化鈉溶液，濕潤樣品，靜置15 min；加入10 mL 0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加蓋密封后在室溫下超聲萃取15 min，然后6 000 r/min離心5 min。取2 mL有機相，GC-MS法分析煙堿質(zhì)量分數(shù)；準確移取5 mL有機相，濃縮至0.5 mL，GCMS法分析其他低質(zhì)量分數(shù)生物堿。煙堿和其他低質(zhì)量分數(shù)生物堿的檢測分兩次進樣完成，采用保留時間和選擇離子（SIM）模式定性，雙內(nèi)標定量。分析條件：

色譜柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)；程序升溫：（10 min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；煙堿檢測進樣量：1μL，分流進樣，分流比40∶1；其他生物堿檢測進樣量：2μL，分流進樣，分流比10∶1。溶劑延遲：8 min；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測模式（SIM），生物堿的選擇離子見表2。

表2 GC-MS檢測生物堿的保留時間及定性、定量離子Tab.2 Retention times and single ion monitoring(SIM)parameters of alkaloid determination by GC-MS

方法7-有機酸：準確稱取20 mg凍干鮮煙葉粉末于2 mL離心管中，加入提取液［二氯甲烷∶乙腈=1∶2（體積比），含內(nèi)標（E）-2-己烯酸，濃度為0.303 μg/L］1 mL；超聲萃取 60 min，靜置；取 500μL上清液，用氮氣吹干后，加入BSTFA 100μL，60℃衍生40 min，進行GC-MS分析。分析條件：

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（50 m×0.25 mm i.d.× 0.25 μm d.f.）；程 序 升 溫 ：80 ℃（0 min）min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0 mL/min；進樣量：1 μL，分流進樣，分流比20∶1。溶劑延遲：7 min；電離方式：EI；電離電壓：70 eV；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測模式（SIM），選擇離子見表3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

靶向分析方法：氨基酸分析方法應用Empower軟件進行數(shù)據(jù)處理；其他靶標方法應用MassHunter軟件進行處理。經(jīng)軟件處理提取定性和定量離子峰，內(nèi)標歸一化后，根據(jù)標準曲線的線性擬合方程對目標代謝物進行定量。

LC-Q/TOF非靶向分析方法：應用MATLAB高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析工具包，對采集的數(shù)據(jù)進行色譜信號基線校正、峰提取與注釋、峰對齊等步驟后最終獲得樣品代謝物的保留時間和精確分子量列表，導入個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫（Personal compound database and library，PCDL）進行搜庫定性分析，采用內(nèi)標歸一化法對代謝物進行相對定量。

1.4 統(tǒng)計分析

將不同方法采集的代謝物的定性和定量數(shù)據(jù)匯總到一起作為代謝組的初始數(shù)據(jù)，采用ANOVA方差分析篩選差異代謝物，主成分分析使用Simca-14軟件進行，對初始數(shù)據(jù)采用Z-score方法進行標準化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮煙葉冷凍樣品與凍干樣品色素質(zhì)量分數(shù)的比較

鮮煙葉樣品凍干前后進行稱量，得到失水率，按照失水率計算冷凍鮮煙葉樣品的取樣量，使冷凍鮮煙葉樣品和凍干鮮煙葉樣品的干物質(zhì)質(zhì)量相同，冷凍鮮煙葉和凍干鮮煙葉各稱取6份，按照YC/T 382—2010［31］的方法測定煙葉色素的質(zhì)量分數(shù)，如表4所示。除紫黃質(zhì)外，各色素質(zhì)量分數(shù)在冷凍鮮煙葉和凍干鮮煙葉之間差異不顯著，表明冷凍干燥對煙葉色素的影響較??；紫黃質(zhì)在鮮煙葉中的質(zhì)量分數(shù)較低，在凍干鮮煙葉中沒有檢測到，可能是由于在凍干過程中存在一定的降解，使紫黃質(zhì)的量降低到檢測限以下；稱取的6份冷凍鮮煙葉色素質(zhì)量分數(shù)的變異較大，除紫黃質(zhì)外，RSD均在20%以上，新黃質(zhì)的RSD更是超過30%，這可能是由于冷凍煙葉易融化，稱取時不易操作，難以準確稱??；相比而言，凍干鮮煙葉的RSD值則均較低，最高的新黃質(zhì)為10.8%，其他均在4%以下。色素質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果表明，鮮煙葉冷凍干燥對代謝物質(zhì)量分數(shù)的影響較小，具有較低的RSD值，可以大幅提高測定結(jié)果的重復性和可靠性，同時凍干鮮煙葉可以在室溫下操作，有利于準確稱取，尤其適宜于大批量鮮煙葉樣本的操作。因此鮮煙葉代謝組學分析采用凍干煙葉進行。

表4 冷凍鮮煙葉與凍干鮮煙葉色素的質(zhì)量分數(shù)（n=6）Tab.4 Phytochrome contents in frozen and freeze-dried fresh tobacco leaves（n=6） ［μg·(g·DW)-1］

2.2 方法學表征

2.2.1 線性關系、檢出限及定量限

按照1.2節(jié)方法分別配制靶向檢測方法中所含標準品的系列濃度溶液，內(nèi)標法進行線性回歸分析。各靶向方法中目標物的線性回歸方法及相關系數(shù)見表5～表7?？梢姡谝欢舛确秶鷥?nèi)，各標準品的質(zhì)量濃度與相對峰面積具有良好的線性相關性，R2均大于0.99。采用稀釋混合標準溶液的方法，分別以3倍和10倍信噪比確定檢出限和定量限。

表5 游離氨基酸的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.5 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of free amino acids

表5（續(xù)）

表6 生物堿類化合物的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.6 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of alkaloid compounds

表7 有機酸類化合物的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.7 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of organic acids

2.2.2 方法重復性、儀器精密度及回收率

準確稱取6份新鮮煙葉樣品粉末進行平行處理，測定4個靶向方法的重復性。選擇其中1份樣品連續(xù)進樣8次，檢測儀器的日內(nèi)精密度；將該樣品每天連續(xù)進樣8次并重復4 d，檢測儀器的日間精密度；用新鮮煙葉樣品粉末作為基質(zhì)，選取高、中、低3個濃度水平進行4個靶向方法的加標回收率實驗，每個濃度水平分別重復3次，結(jié)果取平均值，然后計算每個方法的回收率。實驗結(jié)果見表8～表11。

表8 煙葉游離氨基酸測定方法的重復性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.8 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for free amino acids in tobacco leaves

表8（續(xù)）

表9 煙葉生物堿測定方法的重復性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.9 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for alkaloids in tobacco leaves

表10 煙葉有機酸測定方法的重復性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.10 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for organic acids in tobacco leaves

表10（續(xù)）

表11 非靶向LC-MS測定方法的重復性和日內(nèi)、日間精密度Tab.11 Repeatabilities,intra-day precisions and inter-day precisions of untarged LC-MS method

2.3 氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術在鮮煙葉代謝組學研究中的應用

2.3.1 代謝組數(shù)據(jù)采集結(jié)果

利用所建立的基于GC-MS和LC-MS技術的煙草代謝組學檢測方法，共獲得定性定量代謝物522個。如表12所示，涉及糖代謝、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝等初生代謝途徑，以及苯丙烷代謝、類黃酮代謝、異戊二烯代謝、生物堿代謝等次生代謝途徑，其中通過標準曲線進行絕對定量的代謝物有101個，其他均為相對定量。

2.3.2 不同產(chǎn)區(qū)不同時期第十葉位煙葉代謝組表型分析

為了分析第十葉位葉片隨生長發(fā)育其代謝組的變化情況，將獲取的第十葉位鮮煙葉代謝組數(shù)據(jù)匯總到一起，由于不同代謝物之間質(zhì)量分數(shù)的差異較大、定量方式不同等原因，在進行多元變量統(tǒng)計分析之前，將數(shù)據(jù)作標準化（Z-score）處理。主成分分析（PCA）結(jié)果表明，不同時期、不同產(chǎn)區(qū)煙葉的代謝組有按照產(chǎn)區(qū)聚集的特征。如圖1所示，河南襄縣種植的3個品種與貴州遵義和云南祥云產(chǎn)區(qū)的代謝組差異明顯，遵義種植的3個品種則與清香型產(chǎn)區(qū)云南的3個品種在代謝組上較為接近。從各個產(chǎn)區(qū)的品種差異來看，河南襄縣種植的3個品種在代謝組上的差異最為明顯，尤其是在下部葉成熟期之前的各時期，3個品種的代謝組差異較大；云南種植的3個品種下部葉成熟期之后差異較大；貴州種植的3個品種中紅大與K326的代謝組較為接近，而與中煙100的代謝組在整個生育期的差異均較明顯；從生長發(fā)育時期來看，在主成分圖上，各個產(chǎn)區(qū)不同品種隨生長發(fā)育的變化情況較為一致；河南產(chǎn)區(qū)從時期3（盛花期）至時期4（下部葉成熟期）的代謝組變化最大，這一時期對應于打頂這一農(nóng)藝措施；相比而言打頂對貴州和云南產(chǎn)區(qū)煙葉代謝組的影響較小，兩個產(chǎn)區(qū)煙葉代謝組主要在下部葉成熟期后，不同時期之間的差異更大，而河南煙葉在這一時期后代謝組的變化相對較小。以上分析表明，不同品種種植在同一產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出相似的生長發(fā)育特征，而同一品種種植在不同產(chǎn)區(qū)其生長發(fā)育特征差異較大，即產(chǎn)區(qū)的生態(tài)特征對煙草生長發(fā)育的影響大于品種。

表12 鮮煙葉代謝組數(shù)據(jù)采集結(jié)果Tab.12 Identified metabolites from fresh tobacco leaves by metabolomics analysis

圖1 3個產(chǎn)區(qū)第十葉位6個關鍵生育期的代謝軌跡Fig.1 Metabolic trajectory of PCA score plot for the tenth leaves at six key growth stages from three areas

2.3.3 胺類代謝物隨煙葉生長發(fā)育的累積規(guī)律分析

對第十葉位鮮煙葉代謝組的進一步分析表明，絕大部分代謝物在不同生長發(fā)育時期的差異均達到顯著水平（p＜0.05）。本研究中對差異顯著的胺類（含游離氨基酸）代謝物進行了累積規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分胺類物質(zhì)包括游離氨基酸的積累均較有規(guī)律，其中大部分（30種）的質(zhì)量分數(shù)均表現(xiàn)出隨生長發(fā)育逐漸降低的變化趨勢?？傮w上看，這些胺類代謝物在成熟期煙葉中的質(zhì)量分數(shù)一般比旺長期、現(xiàn)蕾期等生長前期（1～3）低，僅有丙酰胺丙氨酸和多巴胺隨生長發(fā)育其質(zhì)量分數(shù)增加，其余氨基酸在3個產(chǎn)區(qū)、3個品種煙葉中的積累規(guī)律不一致，主要受產(chǎn)區(qū)的影響，即在同一產(chǎn)區(qū)的煙葉中積累規(guī)律較為一致，如色胺，其質(zhì)量分數(shù)在河南襄縣煙葉中表現(xiàn)出明顯的隨生長發(fā)育增加的趨勢，而在云南祥云煙葉中的趨勢則相反（圖2）。

圖2 胺類化合物質(zhì)量分數(shù)隨煙草生長發(fā)育的變化趨勢Fig.2 Variations of amine compound contents in tobacco leaves at different growth stages

3 結(jié)論與討論

采用田間液氮速凍、干冰包埋運輸、超低溫保存、冷凍干燥等方法獲取適用于鮮煙葉代謝組分析的樣品；建立了基于GC-MS和LC-MS技術的鮮煙葉代謝組分析方法，涵蓋多種煙草初生和次生代謝產(chǎn)物；通過對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的歸一化處理進行絕對定量和相對定量，獲得代謝物質(zhì)量分數(shù)信息；通過對多種方法代謝組數(shù)據(jù)的標準化進行多變量統(tǒng)計分析，結(jié)合其他統(tǒng)計分析方法來篩選、分析關鍵代謝物，確定了基于GC-MS和LC-MS技術的鮮煙葉代謝組分析流程，見圖3。

圖3 基于氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術的鮮煙葉代謝組分析流程Fig.3 Workflow of metabolomics analysis of fresh tobacco leaves based on GC-MS and LC-MS

對2014年采集的不同產(chǎn)區(qū)、不同生育時期的第十葉位鮮煙葉進行了代謝組分析，定性鮮煙葉中522種代謝物。主成分分析結(jié)果表明：不同生長發(fā)育時期的煙葉代謝組差異較大，隨葉片生長衰老，不同代謝物表現(xiàn)出不同的積累規(guī)律，多數(shù)胺類物質(zhì)（包括游離氨基酸）隨生長發(fā)育其質(zhì)量分數(shù)逐漸降低；不同產(chǎn)區(qū)、不同品種煙葉具有按照產(chǎn)區(qū)進行聚集的特點，即生態(tài)因素對煙葉代謝組的影響要大于品種因素。這也與烤后煙葉分析的結(jié)果一致，如對清香型風格不同產(chǎn)區(qū)烤煙的研究表明生態(tài)對煙葉的香味風格和化學成分的影響最大［37］。