趙巧雅，馬秀麗，劉存霞，史玉穎，胡 峰，王貴升，蘭鄒然，黃 兵

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250023；2.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022）

肺炎克雷伯氏菌病是由肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）引起的，以肺炎和其他器官化膿性炎癥為特征的人獸共患散發(fā)性疾病。青年兔、成年兔感染肺炎克雷伯氏菌后，以肺炎及其他器官化膿性病灶為主要病變特征，幼兔則以腹瀉為特征。各種年齡、品種和性別的兔均對本菌易感，但以斷奶前后仔兔以及妊娠母兔易感性最高，危害也最為嚴(yán)重[1]，且不同種源的肺炎克雷伯氏菌具有種屬特異性[2]。目前常用的肺炎克雷伯氏菌檢測方法有生化鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。傳統(tǒng)方法檢測過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且靈敏度較低，而常規(guī)PCR方法必須經(jīng)過變性、退火、延伸3個(gè)步驟，需要特殊的基因擴(kuò)增儀器，因此亟需建立一種快速、簡便的檢測肺炎克雷伯氏菌的方法。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification assay，RPA）作為一種新型的快速檢測技術(shù)，對儀器設(shè)備要求較低，在水浴鍋、保溫杯中即可進(jìn)行反應(yīng)，目前已被廣泛應(yīng)用到細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多個(gè)領(lǐng)域的檢測[3-5]。phoE基因是肺炎克雷伯氏菌的核心基因，其保守區(qū)段可用于基因分型[6]。因此，本研究針對兔源肺炎克雷伯氏菌的phoE基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了適宜于快速準(zhǔn)確檢測兔源肺炎克雷伯氏菌的RPA方法，這為兔場生產(chǎn)中的肺炎克雷伯氏菌鑒定和檢測提供了一個(gè)新方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

用標(biāo)準(zhǔn)菌株以及本實(shí)驗(yàn)室保存菌株進(jìn)行試驗(yàn)（表1）。

表1 試驗(yàn)用菌株

1.2 試劑

TwistAmp Basic試劑盒：購自北京強(qiáng)欣博瑞生物科技有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker：購自 TaKaRa 公司；酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉等細(xì)菌培養(yǎng)基及其他試劑：購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已登錄的兔源肺炎克雷伯氏菌phoE基因序列（CP025636.1）設(shè)計(jì)引物，目的片段277 bp。上游引物F：5'-TTCAACAGCGACGCAGGCAGC-3'；下游引物R：5'-GCCGTAGTTCTTCAGCTTC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

將表1所有菌株分別接種到4 mL LB培養(yǎng)液中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h。取純培養(yǎng)菌液1 mL，備用。

1.5 RPA檢測體系優(yōu)化

以兔源肺炎克雷伯氏菌菌液為模板。RPA反應(yīng)體系：上、下游引物（10 pmol/μL）各 2.4 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL、菌液 1 μL、ddH2O 12.2 μL。漩渦混勻，離心；加入2.5 μL 280 mmol/L MgAc，混勻；放入40 ℃水浴鍋內(nèi)，分別反應(yīng)10、20、30、40 min；取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 特異性和靈敏度檢驗(yàn)

根據(jù)建立的最佳反應(yīng)時(shí)間，將表1中所列菌株的LB培養(yǎng)液作為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)。取兔源肺炎克雷伯氏菌純菌液1 mL做細(xì)菌計(jì)數(shù)，用PBS 10倍梯度稀釋至10-8，用RPA進(jìn)行檢測，同時(shí)與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。

1.7 臨床樣本檢測

采集55份有鼻炎癥狀的兔鼻腔拭子，加入1 mL生理鹽水震蕩后取上清作為模板，采用已建立的RPA方法進(jìn)行檢測，分別與傳統(tǒng)細(xì)菌分離、常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

對RPA反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，在277 bp處均有1條特異性條帶。反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)30 min后，擴(kuò)增效率無明顯變化（圖1），因此將最佳反應(yīng)時(shí)間確定為30 min。

圖1 RPA條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 特異性檢驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有兔源肺炎克雷伯氏菌出現(xiàn)單一目的條帶，巴氏桿菌、波氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等均為陰性（圖2）。

2.3 靈敏性檢驗(yàn)

將肺炎克雷伯氏菌液稀釋至8.3×101CFU/mL后，RPA方法仍能檢出，而常規(guī)PCR方法的最低檢出量為8.3×103CFU/mL（圖3）。

2.4 臨床樣本檢測

對55份樣品進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌檢測，發(fā)現(xiàn)RPA與PCR方法的檢出率一致（表2），與細(xì)菌分離的陽性符合率均為91.67%。

表2 55份臨床樣本檢測結(jié)果

圖3 RPA與PCR的靈敏度比較

3 討論

肺炎克雷伯氏菌是引起人畜食物中毒的重要感染源，可引起小兒腹瀉甚至死亡，導(dǎo)致成人肺炎、肝膿腫、敗血癥、腦膜炎等[7-9]。動(dòng)物感染可導(dǎo)致肺炎、子宮炎以及化膿性炎癥等[10-11]，危害廣泛、嚴(yán)重。目前肺炎克雷伯氏菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)檢測方法和分子生物學(xué)方法[12-13]。傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且靈敏度較低，而PCR方法較為快速，但需要昂貴的檢測儀器，在現(xiàn)場快速檢測方面存在一定的限制。

Cross priming amplification（CPA）或 Loopmediated isothermal amplification（LAMP）方法需要在反應(yīng)中使用多對引物[14-15]，引物設(shè)計(jì)要求較高，導(dǎo)致有些疾病的基因可能不適合使用此方法。RPA等溫檢測方法操作簡單、反應(yīng)快速，核心試劑以凍干顆粒形式保存，因而無需冷藏保存和冷鏈運(yùn)輸；且因反應(yīng)時(shí)間短，可用于現(xiàn)場快速檢測和診斷[4-6]。本研究建立的兔源肺炎克雷伯氏菌RPA等溫檢測法，反應(yīng)10 min即可出現(xiàn)目的條帶，30、40 min的產(chǎn)物沒有明顯差異。由于反應(yīng)體系內(nèi)的重組酶聚合酶活性隨反應(yīng)時(shí)間延長而降低或失活，因此本試驗(yàn)最終確認(rèn)30 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。該方法的菌液最低檢出量為8.3×101CFU/mL，比傳統(tǒng)PCR高100倍。通常引起兔鼻炎或肺炎的細(xì)菌有巴氏桿菌、波氏桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌等。本研究結(jié)果顯示，所建立的方法特異性強(qiáng)，僅能檢測出兔源肺炎克雷伯氏菌，因而有利于上述細(xì)菌的鑒別診斷。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道，RPA的陽性檢出率高于普通PCR。臨床樣品檢測結(jié)果顯示，本方法與細(xì)菌分離的陽性符合率達(dá)到91.67%。

4 結(jié)論

本研究建立的RPA檢測方法特異性強(qiáng)，只有兔源肺炎克雷伯氏菌出現(xiàn)單一目的條帶；靈敏性高，最低檢出量為8.3×101CFU/mL，高出傳統(tǒng)PCR 100倍，臨床樣品檢測結(jié)果同PCR的符合率為100%；操作簡單，不需要特殊的基因擴(kuò)增設(shè)備。因此，本方法適用于基層實(shí)驗(yàn)室對兔肺炎克雷伯氏菌的快速檢測，為生產(chǎn)中的兔源肺炎克雷伯氏菌現(xiàn)場快速檢測提供了一種新方法。