劉曉東，郝堯光，王宗升，王輝之，范根成，杜元釗，董雅琴，高 豐

（1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2. 動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000；3. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)殖環(huán)境較差，疾病錯(cuò)綜復(fù)雜，單純依靠藥物治療不僅不能有效控制疾病，還給豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)的感染率已達(dá)70%以上，造成母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔、奶水質(zhì)量差、返情、屢配不孕以及公豬精子活力弱、仔豬呼吸道癥狀嚴(yán)重等，后期可繼發(fā)細(xì)菌感染，難以控制，嚴(yán)重時(shí)造成豬場(chǎng)大批豬只死亡[1-3]。

豬繁殖與呼吸綜合征和古典豬瘟防疫是目前養(yǎng)豬業(yè)面臨的難題，如何設(shè)計(jì)更加合理的免疫程序?qū)ζ溥M(jìn)行防控是目前急需解決的問(wèn)題。為探討高致病性PRRSV弱毒疫苗的安全性與有效性，確定更加合理的免疫程序，在山東省某規(guī)模化豬場(chǎng)開(kāi)展了PRRSV 弱毒疫苗（TJM-F92株）安全性調(diào)查及有效性和干擾性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 試驗(yàn)疫苗選用高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）與古典豬瘟病毒（CSFV）脾苗，利用疫苗專用稀釋液稀釋，疫苗來(lái)源于山東省青島市某公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 安全性試驗(yàn)：選取母豬30頭；有效性試驗(yàn)：選取不同階段豬群各25頭，共10組250頭，包括母豬（空懷期、妊娠期、哺乳期）和仔豬（2、4、8、12、15、18、25周齡）；干擾性試驗(yàn)：選取12頭仔豬，分為2組，每組6頭。各豬群免疫程序見(jiàn)表1。

1.1.3 試劑與儀器 PRRSV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒、CSFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。其他試劑包括：ELISA反應(yīng)板、洗滌液（10×）、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、TMB底物、終止液等。酶標(biāo)儀：型號(hào)為T(mén)ECAN，購(gòu)自瑞士帝肯公司；離心機(jī)：型號(hào)為T(mén)GL-16，購(gòu)自湘儀公司；微量移液器、槍頭、超凈臺(tái)等：由本實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 不同豬群的PRRSV疫苗免疫程序

1.2 方法

1.2.1 安全性調(diào)查 2018年5月22日，對(duì)選取的30頭母豬接種高致病性PRRSV（TJM-F92株）疫苗，然后分別統(tǒng)計(jì)免疫前后的采食量、體溫變化情況；統(tǒng)計(jì)豬場(chǎng)近1年內(nèi)43周齡母豬免疫該弱毒苗前后的返情比例、流產(chǎn)比例以及死胎、木乃伊胎產(chǎn)生率變化情況。

1.2.2 有效性試驗(yàn) 對(duì)3個(gè)階段（空懷期、妊娠期、哺乳期）的試驗(yàn)?zāi)肛i和7個(gè)生長(zhǎng)周期（2～25周齡）的仔豬各25頭，按表1程序免疫高致病性PRRSV（TJM-F92株）疫苗，然后利用ELISA方法進(jìn)行PRRSV抗體水平跟蹤檢測(cè)。

1.2.3 干擾性試驗(yàn) 第1組（6頭仔豬）：在14日齡進(jìn)行PRRSV（TJM-F92株）疫苗免疫，30、60日齡分別進(jìn)行CSFV疫苗免疫，然后通過(guò)ELISA方法檢測(cè)PRRSV及CSFV抗體；第2組（6頭仔豬）：在14日齡進(jìn)行PRRSV（TJM-F92株）疫苗免疫，30日齡進(jìn)行PRRSV疫苗與CSFV疫苗同時(shí)免疫（頸部肌內(nèi)注射，一邊一針），60日齡CSFV疫苗加強(qiáng)免疫。利用ELISA方法檢測(cè)PRRSV及CSFV抗體。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，觀察PRRSV（TJM-F92株）疫苗與CSFV疫苗間的相互影響。

1.2.4 檢測(cè)及結(jié)果判定 按照各病毒試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。操作過(guò)程大體如下：被檢樣品加入與感作→洗滌→酶標(biāo)二抗感作→洗滌→加入底物→加入終止液終止→OD值測(cè)定與分析。兩種病毒抗體檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

綜上所述,優(yōu)質(zhì)護(hù)理在冠心病心絞痛護(hù)理中的應(yīng)用效果確切,可減輕患者焦慮情緒和提高舒適度,改善心功能,縮短住院時(shí)間,滿意度高。

表2 兩種病毒抗體檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性試驗(yàn)

2.1.1 采食量變化 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，5月22日免疫PRRSV弱毒疫苗后，30頭母豬的平均日采食量與免疫前相比幾乎沒(méi)有變化（圖1），母豬采食行為正常。

2.1.2 體溫變化 30頭母豬5月22日免疫前后的平均體溫均在正常范圍內(nèi)（圖2），未出現(xiàn)高燒、低溫等不正?，F(xiàn)象。

圖1 豬群采食量監(jiān)測(cè)結(jié)果

圖2 豬群體溫監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.2 安全性調(diào)查

2.2.1 返情率 該豬場(chǎng)母豬43周齡免疫PRRSV（TJM-F92株）疫苗后，返情率略有波動(dòng)，但整體穩(wěn)定（圖3）。

2.2.2 流產(chǎn)率 豬場(chǎng)母豬43周齡免疫PRRSV（TJM-F92株）疫苗后生產(chǎn)情況基本正常，未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)增加現(xiàn)象（圖4）。

2.2.3 死胎、木乃伊胎產(chǎn)生率 豬場(chǎng)母豬43周齡免疫PRRSV（TJM-F92株）疫苗后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死胎、木乃伊胎產(chǎn)生率大幅上升現(xiàn)象（圖5）。

圖3 母豬返情比例變化情況

圖4 母豬流產(chǎn)變化情況

圖5 母豬的死胎、木乃伊胎產(chǎn)生率變化情況

2.3 有效性試驗(yàn)

2.3.1 免疫后PRRSV抗體平均值（S/P）及離散度（CV） 母豬每年3次免疫，仔豬14日齡免疫后，各階段豬群抗體S/P值均在0.73～2.45之間；仔豬群免疫PRRSV疫苗后在15周齡抗體水平達(dá)到最高，母豬群在妊娠期抗體水平最高，哺乳期較低，表明豬群在妊娠期對(duì)PRRSV的抵抗力較強(qiáng)。免疫后各階段豬群的抗體水平離散度在13.6%～61.7%之間；仔豬15周齡時(shí)的離散度最低，為13.6%，4周齡時(shí)最高，為61.7%（表3）。

表3 各階段豬群PRRSV抗體平均值（S/P）及離散度（CV）監(jiān)測(cè)結(jié)果

表4 PRRSV抗體（S/P）不同區(qū)間分布情況 單位：%

2.4 干擾性試驗(yàn)

2.4.1 分開(kāi)免疫

2.4.1.1 CSFV抗體 對(duì)6頭試驗(yàn)仔豬14日齡進(jìn)行PRRSV疫苗免疫，30、60日齡進(jìn)行CSFV疫苗免疫，發(fā)現(xiàn)CSFV疫苗免疫前的CSFV抗體阻斷率平均值為22.7%，離散度為37.2%；一免后CSFV抗體阻斷率平均值為52.8%，離散度為11.4%；二免后CSFV抗體阻斷率平均值為67.0%，離散度為7.84%（表5）。由此可見(jiàn)：CSFV抗體在一免后較低，二免后才達(dá)到較高水平，且離散度也隨之降低，說(shuō)明CSFV疫苗二免保護(hù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于一免。

2.4.1.2 PRRSV抗體 對(duì)6頭試驗(yàn)仔豬14日齡免疫PRRSV疫苗，30日齡免疫CSFV疫苗后發(fā)現(xiàn)：免疫前PRRSV抗體S/P平均值為1.11，離散度為28.4%；一免后抗體平均值為2.13，離散度為12.5%（表6），說(shuō)明14日齡時(shí)免疫1次PRRSV疫苗，30日齡后即可提供較高的保護(hù)。

2.4.2 聯(lián)合免疫

2.4.2.1 CSFV抗體 對(duì)6頭試驗(yàn)仔豬，在30日齡進(jìn)行CSFV疫苗與PRRSV疫苗同時(shí)免疫，發(fā)現(xiàn)免疫前CSFV抗體阻斷率平均值為18.5%，離散度為45.3%；一免后CSFV抗體阻斷率平均為54.3%，離散度為14.9%；二免后CSFV抗體阻斷率平均為66.5%，離散度為16.5%（表7）。這說(shuō)明同時(shí)免疫CSFV活苗與PRRSV疫苗（TJM-F92株）后，CSFV抗體表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)被PRRSV抑制的現(xiàn)象。

2.4.2.2 PRRSV 抗體 對(duì)6頭試驗(yàn)仔豬30日齡時(shí)進(jìn)行CSFV疫苗與PRRSV疫苗同時(shí)免疫，發(fā)現(xiàn)免疫前PRRSV抗體S/P平均值為0.99，離散度為39.2%；一免后PRRSV抗體S/P平均值為2.36，離散度為15.6%（表8）。此結(jié)果表明，30日齡時(shí)，CSFV疫苗與PRRSV疫苗同時(shí)免疫對(duì)PRRSV抗體產(chǎn)生無(wú)影響。

表5 免疫CSFV疫苗后抗體（阻斷率）監(jiān)測(cè)結(jié)果 單位：%

表6 免疫PRRSV疫苗后PRRSV抗體（S/P）監(jiān)測(cè)結(jié)果

表7 同時(shí)免疫后CSFV抗體（阻斷率）監(jiān)測(cè)結(jié)果 單位：%

3 討論

本次安全性試驗(yàn)和調(diào)查表明，高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）對(duì)母豬免疫后，無(wú)論采食量、體溫、返情率及死胎與木乃伊胎產(chǎn)生率均無(wú)變化，說(shuō)明高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）具有良好的安全性，這與王科文[4]的研究結(jié)論一致。

表8 同時(shí)免疫后PRRSV抗體（S/P）監(jiān)測(cè)結(jié)果

利用高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株），按規(guī)定程序每頭豬1頭份肌內(nèi)注射，可使各個(gè)階段豬群均產(chǎn)生有效保護(hù)力，因此在實(shí)際應(yīng)用中，不需加大免疫劑量。

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，不同病毒疫苗同時(shí)免疫會(huì)產(chǎn)生干擾作用[5-6]。杜喜忠等[7]認(rèn)為PRRSV弱毒苗和CSFV疫苗同時(shí)免疫的相互干擾影響最大。但本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)免疫高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）和CSFV凍干疫苗的免疫效果與分開(kāi)免疫并無(wú)差異，不會(huì)相互影響，由此認(rèn)為高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）與CSFV疫苗間的相互免疫抑制作用較小，可以在現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)中優(yōu)化免疫程序，實(shí)施同時(shí)免疫，從而節(jié)省人力，減少豬群應(yīng)激。

因?yàn)镻RRSV的發(fā)病機(jī)理以及免疫機(jī)制非常復(fù)雜，不同的試驗(yàn)條件、不同的試驗(yàn)豬群所得到的結(jié)果可能不盡相同，所以本試驗(yàn)結(jié)果具有一定局限性，需要后續(xù)開(kāi)展系統(tǒng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本次研究發(fā)現(xiàn)：高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）具有優(yōu)秀的安全性，可以對(duì)母豬進(jìn)行普免，不會(huì)引起不良反應(yīng)，對(duì)各階段豬群均可產(chǎn)生有效保護(hù)，有效性較好；高致病性PRRSV弱毒疫苗（TJM-F92株）與CSFV疫苗同時(shí)免疫不會(huì)產(chǎn)生相互干擾，因而豬場(chǎng)可以嘗試優(yōu)化免疫程序，對(duì)兩種疫苗同時(shí)免疫，以減少應(yīng)激，節(jié)省人力。