李清正，張振凌，閆夢(mèng)真，孟冉

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

山萸肉為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，其味酸、澀，微溫，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫之功。臨床常用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥。經(jīng)酒制后，補(bǔ)益肝腎作用增強(qiáng)[1]。山萸肉主要含環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)等成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、抗炎、抗疲勞、降血糖、抗失血性休克和抗艾滋病[2]，還有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、防治骨質(zhì)疏松、抑制血小板聚集、保肝的作用[3]。目前，市場(chǎng)上流通的山茱萸主要炮制品種包括酒蒸山茱萸、蒸山茱萸、醋山茱萸、鹽山茱萸等，且以酒萸肉為主要品種[4]。

傳統(tǒng)山茱萸的產(chǎn)地加工方式多采用去核直接進(jìn)行干燥得到山萸肉飲片，然而上述加工方式在保存過(guò)程中存在易變色、發(fā)黏、蟲(chóng)蛀等弊端，且不同采收期山茱萸有效成分含量也有所不同，盡量保證在10月份最佳采收期進(jìn)行采摘，因此亟需新的炮制方法進(jìn)行優(yōu)化，以保障山茱萸飲片質(zhì)量[5]。歷代文獻(xiàn)對(duì)山茱萸的炮制工藝進(jìn)行了詳細(xì)的描述，《本草述鉤元》云：“酒拌潤(rùn)去核取皮，酒蒸一炷香[6]”；《活幼心書(shū)》云：“酒浸潤(rùn)，蒸透，去核取皮為用[7]”；《增廣驗(yàn)方新編》云：“酒浸、蒸、曬干[8]”；《炮炙大法》云：“酒拌，砂鍋上蒸去核了，一斤取肉皮用，只秤成四兩已來(lái)，凡蒸藥用柳木甄，去水八九寸水不犯上，余悉準(zhǔn)此[9]”。由此可見(jiàn)，酒蒸制手段得到酒萸肉飲片，在保存過(guò)程中性質(zhì)穩(wěn)定。本研究根據(jù)古文獻(xiàn)的相關(guān)記載，結(jié)合飲片廠的實(shí)際生產(chǎn)需求，以干燥時(shí)間、干燥溫度、加酒量和蒸制時(shí)間為考察因素，采用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以馬錢(qián)苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛的含量和酒萸肉外觀性狀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)分優(yōu)選酒萸肉一體化炮制工藝參數(shù)，為酒萸肉飲片加工炮制一體化的實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 1525高效液相色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)；Waters2487紫外檢測(cè)器；25 μL進(jìn)樣針(SGE Analytical Science，Part 003300 25F-LC，25 μL Syringe)；Waters SunFire?C18色譜柱；BT25S型十萬(wàn)分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，Max=21 g，d=0.01 mg)；DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎機(jī)(德清拜杰電器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；YP10002電子天平(上海衡際科學(xué)儀器有限公司，Max=1000 g，d=0.01 g)；蒸鍋；微電腦電陶爐(額定功率：2200 W)；一次性使用無(wú)菌注射器帶針(圣光醫(yī)用制品股份有限公司)；《中國(guó)藥典》篩(浙江上虞市五四儀器篩具廠)。

1.2 試藥

實(shí)驗(yàn)用山茱萸新鮮果實(shí)購(gòu)自河南南陽(yáng)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的成熟果實(shí)。

沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)分別為：PS0258-0050、PS0500-0025、PS13031401、PS1517-0100)；黃酒；水為超純水；乙腈、甲醇均為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法的設(shè)計(jì)與比較

山萸肉在酒蒸過(guò)程中，環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量會(huì)有不同程度的降低，因此在相同蒸制條件下，以山萸肉外觀性狀達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的蒸制最短時(shí)間為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)了酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法，見(jiàn)表1～2。

表1 酒萸肉加工炮制一體化方法的設(shè)計(jì)與比較

表1中，按照每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min的方法進(jìn)行蒸制，蒸制2 h后酒萸肉均為腐熟狀態(tài)，不能達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》要求的外觀性狀，所以對(duì)一體化炮制工藝的方法進(jìn)行改進(jìn)。

表2 改進(jìn)后酒萸肉加工炮制一體化方法的設(shè)計(jì)與比較

表2中，按照每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min，100 ℃條件下干燥2 h進(jìn)行蒸制，并記錄山萸肉的外觀性狀，達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間。1號(hào)樣品蒸制時(shí)間在2 h達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，2號(hào)樣品在蒸制3 h，3號(hào)樣品在蒸制4 h后外觀性狀達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》以馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量為質(zhì)量控制指標(biāo)。山茱萸飲片中馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)有不同程度的降低[10]。因此，選擇1號(hào)樣品的蒸制條件作為酒萸肉一體化加工炮制方法。

2.2 酒萸肉產(chǎn)地加工一體化工藝參數(shù)的優(yōu)選

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)2.1項(xiàng)下酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法的結(jié)果，選取干燥溫度(A)、干燥時(shí)間(B)、加酒量(C)和蒸制時(shí)間(D)為考察因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表制備酒萸肉樣品，取大小均勻的鮮山茱萸去核，分成9份，每份100 g，加入相應(yīng)量的黃酒浸潤(rùn)30 min，攤開(kāi)，放入烘箱，在80、90、100 ℃的條件下分別干燥1、2、3 h，取出放入蒸鍋內(nèi)蒸制。

表3 酒萸肉正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.2.2 外觀性狀評(píng)分 按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[11]“山茱萸”項(xiàng)下“酒萸肉”外觀描述“表面紫黑色或黑色，質(zhì)滋潤(rùn)柔軟，微有酒香氣”為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)9組實(shí)驗(yàn)樣品外觀性狀評(píng)分。

2.2.3 沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛的含量測(cè)定

2.2.3.1 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.022、1.005、0.880、0.030 mg·mL-1的對(duì)照品母液。精密吸取各對(duì)照品母液0.50、2.00、2.00、1.00 mL，共置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為：0.051 1、0.201 0、0.176 0、0.003 0 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3.3 色譜條件 SunFire?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸-乙腈(A)梯度洗脫(0～5 min，2%～5%A；5～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～50 min，15%～45%A；50～60 min，45%～100%A；60～70 min，100%～2%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm(沒(méi)食子酸)、240 nm(莫諾苷、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛)；柱溫：30 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1，色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.酒萸肉制品；1.沒(méi)食子酸；2.5-羥甲基糠醛；3.莫諾苷；4.馬錢(qián)苷。圖1 混合對(duì)照品和酒萸肉制品色譜圖

2.2.3.4 線性范圍的考察 分別精密吸取1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL混合對(duì)照品溶液，按照2.2.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3.5 精密度試驗(yàn) 將一定濃度的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，分別測(cè)得馬錢(qián)苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸和5-羥甲基糠醛的RSD為：0.34%、0.42%、0.37%和0.53%，表明儀器精密度良好。

表4 沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛4種成分的回歸方程及線性范圍

2.2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)定樣品0.2 g，共6份，按照2.2.3項(xiàng)下制備成供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行分析，測(cè)定沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為0.29%、0.61%、1.16%和0.68%。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8、24 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定馬錢(qián)苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為1.37%、1.23%、1.30%和1.34%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.8 加樣回收率 分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛對(duì)照品0.133、1.502、0.869、0.459 mg置10 mL容量瓶?jī)?nèi)搖勻，作為對(duì)照品溶液，精密稱(chēng)取已知含量的正交8號(hào)樣品0.1 g，共6份，每組按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求精密加入各對(duì)照品溶液，按照2.2.3.1項(xiàng)下制備供試品溶液，按照2.2.3.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷、莫諾苷和5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率分別為98.42%、101.28%、98.37%、98.80%，RSD分別為0.61%、1.78%、0.75%、1.61%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.4 含量測(cè)定 將樣品干燥，粉碎過(guò)三號(hào)篩，按照2.2項(xiàng)下方法測(cè)定馬錢(qián)苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸和5-羥甲基糠醛的含量。

2.2.5 結(jié)果分析 正交試驗(yàn)結(jié)果以馬錢(qián)苷(A1)、莫諾苷(A2)、沒(méi)食子酸(A3)、5-羥甲基糠醛(A4)和外觀性狀(A5)5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，用綜合指標(biāo)評(píng)分法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。馬錢(qián)苷和莫諾苷作為酒萸肉的指標(biāo)性和有效成分，其含量對(duì)酒萸肉質(zhì)量控制有重要影響，故設(shè)定其權(quán)重系數(shù)分別為0.2，沒(méi)食子酸和5-羥甲基糠醛設(shè)定其權(quán)重系數(shù)為0.1，酒萸肉的外觀性狀權(quán)重系數(shù)為0.4。

綜合評(píng)分=0.2A1/A1max×100+0.2A2/A2max×100+0.1A3/A3max×100+0.1(0.183-A4)/A4max+0.4A5/A5max×100

(1)

綜合加權(quán)評(píng)分法評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.000；*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由表7可知，各因素對(duì)酒萸肉飲片產(chǎn)地加工一體化的影響順序是A>D>B>C，其中A因素具有顯著性。L9(34)試驗(yàn)直觀分析的最佳工藝組合是A3B3C2D1，因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝為：每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

取新鮮山茱萸，平均分成3份，每份1 kg，分別按照上述優(yōu)選的工藝(每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥)對(duì)酒萸肉飲片中的馬錢(qián)苷、莫諾苷、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛和外觀性狀進(jìn)行綜合評(píng)分，驗(yàn)證一體化工藝的合理性，評(píng)分按照2.2.2項(xiàng)下進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

由綜合評(píng)分結(jié)果可知，最佳工藝的平均得分為79.953，工藝驗(yàn)證的RSD值為3.60%，以上結(jié)果表明，酒萸肉產(chǎn)地加工一體化炮制工藝穩(wěn)定可行，且馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量高于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，為《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的3.79倍。

3 討論

山茱萸的傳統(tǒng)干燥方式主要有曬干和烘干兩種方法，無(wú)具體干燥工藝參數(shù)。酒萸肉的干燥溫度控制在80 ℃左右，將新鮮去核的山茱萸在100 ℃下干燥，這實(shí)際上已經(jīng)相當(dāng)于酒山茱萸的蒸制過(guò)程，因此提高了干燥溫度就相當(dāng)于縮短了酒萸肉的再次蒸制時(shí)間[12]，因此將干燥溫度水平分別設(shè)定為80、90、100 ℃。結(jié)合酒萸肉的外觀性狀，蒸制2 h其外觀性狀可達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，而傳統(tǒng)炮制方法制備的酒萸肉飲片一般4 h以上可達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典》要求，故將蒸制時(shí)間水平設(shè)定為1、2、3 h。

馬錢(qián)苷和莫諾苷為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[11]中規(guī)定的酒萸肉的質(zhì)量控制指標(biāo)。鄭雪花等[13]通過(guò)對(duì)沒(méi)食子酸的研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)食子酸具有抗高血壓、抗心肌梗死、抗血管鈣化、抗糖尿病、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，其含量經(jīng)炮制后明顯增加。5-羥甲基糠醛(5-HMF)具有抗心肌缺血、抗氧化作用，對(duì)急性小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[14]。5-HMF為糖類(lèi)加熱分解后的產(chǎn)物，經(jīng)加熱炮制后5-HMF的含量明顯增加。以上4種成分具有特有的藥理作用，因此我們選擇以上4種成分作為含量測(cè)定指標(biāo)。

傳統(tǒng)山茱萸的產(chǎn)地加工方式多采用去核后直接干燥得到山萸肉，不同的炮制工藝對(duì)莫諾苷的含量有一定的影響，在產(chǎn)地加工炮制的全過(guò)程中耗費(fèi)大量時(shí)間，而且制備酒萸肉飲片時(shí)，需加入黃酒再次進(jìn)行浸潤(rùn)，會(huì)造成有效成分的大量損失。與傳統(tǒng)酒萸肉飲片加工工藝相比，一體化加工工藝制備的酒萸肉飲片，于100 ℃的條件下干燥后蒸制1 h，而傳統(tǒng)酒萸肉加工蒸制時(shí)間為4 h，節(jié)省了大量的時(shí)間，并有效地保存了山茱萸中的有效成分。不同的炮制工藝對(duì)莫諾苷的含量有不同程度的影響[15]，本工藝中馬錢(qián)苷和莫諾苷含量高于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果表明，一體化工藝能夠縮短酒萸肉飲片的傳統(tǒng)加工炮制周期，降低貯藏保管難度，提高酒萸肉飲片質(zhì)量，且工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行，可為酒萸肉飲片的一體化生產(chǎn)提供參考。