高晶萍 李珮瑤 王存連 張瑞華 范玉堂 程智慧 徐彤

摘? 要：目的：確定內蒙古某奶牛場初生犢牛發(fā)生腹瀉并導致嚴重死亡的病因，以便針對性采取有效的防控措施。方法：采集發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴以及小腸，無菌操作進行細菌分離鑒定;分離菌株純培養(yǎng)后進行動物致病性試驗和藥敏試驗。結果：在送檢3例犢牛肝臟、脾臟及小腸接種培養(yǎng)基上，具有大腸桿菌菌落的典型特征，生化鑒定為大腸桿菌;在1例犢牛肺接種培養(yǎng)基上分離1株符合綠膿桿菌的菌落特征，生化鑒定為綠膿桿菌。致病性試驗顯示，大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物接種小鼠腹腔后24h內全部死亡;綠膿桿菌菌株肉湯培養(yǎng)物也導致接種小鼠在48h死亡。藥敏試驗結果顯示，大腸桿菌對阿米卡星、頭孢哌酮和頭孢吡肟敏感;對諾氟沙星、慶大霉素、復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥;綠膿桿菌對頭孢吡肟、諾氟沙星、妥布霉素、慶大霉素和頭孢哌酮敏感，對復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥。結論：大腸桿菌是引起該場犢牛腹瀉死亡的主要病原菌，在抵抗力下降的情況下，部分犢牛繼發(fā)感染了綠膿桿菌，也是導致死亡的原因之一。

關鍵詞：犢牛腹瀉;大腸桿菌;分離鑒定;藥敏試驗;防治

中圖分類號 S858.23 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）11-0085-3

犢牛腹瀉是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病，發(fā)病原因有病原性感染和營養(yǎng)因素等。大多數(shù)犢牛腹瀉主要發(fā)生于犢牛出生后2周內，但在環(huán)境條件較差時，3～4周齡也仍然具有較高的易感性。在傳染性因素中，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的一種主要致病菌。臨床表現(xiàn)為腹瀉、脫水，嚴重者因機體脫水、酸中毒死亡。大腸桿菌的發(fā)病率和死亡率，因飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生的不同，具有較大的差異[1-2]。犢牛腹瀉一般在氣溫驟降及陰雨連綿的時期多發(fā)，任何降低犢牛抵抗力的因素都會導致本病的發(fā)生[3]。近年來，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)集約化程度的提高，犢牛大腸桿菌病的發(fā)病率日趨增加，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的威脅。

2019年2月份，內蒙古某奶牛場飼養(yǎng)的犢牛發(fā)生腹瀉，引起大量的死亡，根據(jù)流行病學和臨床癥狀懷疑為大腸桿菌，用慶大霉素、氟苯尼考和恩諾沙星等藥物后治療無效。為了進一步確診病因，采集發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸等到河北北方學院進行了實驗室診斷，為臨床合理防控提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 內蒙古某規(guī)模養(yǎng)殖場飼養(yǎng)奶牛約900余頭，采用集中發(fā)情和配種方式繁殖。2018年11月至2019年1月，在其1號和3號養(yǎng)殖棚內出生犢牛陸續(xù)發(fā)生腹瀉，用氨芐西林鈉與慶大霉素、氟苯尼考及恩諾沙星等進行治療，有效控制了此次犢牛腹瀉。然而，2019年2月初，該場2號棚陸續(xù)出生250余頭犢牛，出生不久后，部分犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便逐漸變成粥狀，內含未消化的乳凝塊和血液，逐漸消瘦、虛弱、走路搖擺;至來校診斷時約有50%的犢牛發(fā)生腹瀉，病死率20%。剖檢變化主要在小腸，表現(xiàn)為小腸充盈、內有液狀內容物和灰白色的乳凝塊;腸黏膜變薄，有的嚴重出血，呈暗紅色;腸系膜淋巴結腫脹、出血。發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸送檢，低溫保存，當日檢查。

1.2 試劑與儀器 麥康凱培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色液均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;生化反應檢測管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物制劑有限公司。超凈臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;顯微鏡購自Olympus;電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 實驗動物 6～8周齡SPF級BALB/c小鼠24只，由北京實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 細菌的分離鑒定 將病料無菌操作、釣菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱中24h過夜培養(yǎng)。挑取單個典型疑似菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 細菌生化鑒定 將純化后的單個菌落接種于生化試驗管中37℃培養(yǎng)24h后，觀察并記錄結果。

2.3 動物致病性試驗 24只SPF小白鼠隨機分成2組，試驗組為20只，對照組為4只。試驗組的小鼠腹腔接種肉湯培養(yǎng)物，每只0.1mL，對照組用等量的滅菌普通肉湯進行腹腔注射。48h內觀察小鼠的精神狀態(tài)和記錄死亡情況。

2.4 藥敏試驗 將分離到的菌落均勻地涂抹到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌鑷子貼上藥敏片后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24h后測量抑菌圈直徑的大小。結果判定參照NCCLS（2009）的[4]。

3 結果與分析

3.1 細菌的分離鑒定 從病料中共分離出4株細菌，分別編號為S1～S4。S1～S3在麥康凱培養(yǎng)基上長出粉紅色、圓形凸起、表面濕潤、邊緣整齊的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌;S4在營養(yǎng)瓊脂上長出整體黃綠色的菌落，鏡檢為兩端鈍圓、長短不一的革蘭陰性短桿菌。

3.2 細菌生化鑒定結果 生化試驗結果顯示，S1～S3分離菌符合大腸桿菌的生化特性（表1）。S4分離菌符合綠膿桿菌的生化特性（表2）。

3.3 動物致病性試驗 觀察接種肉湯培養(yǎng)物的小鼠，接種S1、S2、S3、S4以及S1～S4混合菌液肉湯培養(yǎng)物的小鼠，4只/組。接種S1肉湯培養(yǎng)物的4只小鼠在24h內均死亡;S2和S3接種小鼠24h內死亡2只，24～48h死亡2只;S4接種小鼠48h內4只全部死亡;S1～S4混合菌液24h內4只全部死亡。死亡小白鼠在接種12h后可見精神萎靡，腹瀉、被毛蓬松等癥狀。無菌條件下采取小鼠的肝臟進行細菌分離培養(yǎng)，鑒定結果與分離菌相同。

3.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗結果（見表3），分離大腸桿菌對阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢哌酮敏感，對諾氟沙星、慶大霉素、氨芐西林鈉、復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥;綠膿桿菌對阿米卡星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮、妥布霉素敏感，對復方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥。

4 討論

經(jīng)細菌的分離鑒定，從送檢的3份病料中均分離出了大腸桿菌，從其中的1份病料的肺臟中分離出了綠膿桿菌。結合流行病學和臨床癥狀、小鼠的致病性試驗以及送檢前后的臨床治療用藥情況，判定引起該場犢牛腹瀉死亡的主要原因為大腸桿菌感染。盡管1例犢牛肺部分離到綠膿桿菌且其具有較強的致病作用（導致實驗感染小鼠死亡），但是實驗室藥敏試驗確定為敏感的藥物如慶大霉素、諾氟沙星以及氨芐西林等在臨床治療時均未能減少犢牛死亡，因此，綠膿桿菌可能只是部分犢牛在機體抵抗力下降的情況下繼發(fā)感染的因素。綠膿桿菌主要引起水貂的出血性肺炎、或是在畜禽繼發(fā)感染[5-6]。但由綠膿桿菌引起的犢牛腹瀉不容忽視，1985年彭德勛報道過由綠膿桿菌引起犢牛腹瀉的診斷和治療[7]。因此，綠膿桿菌是否是導致本次犢牛腹瀉的致病菌還需進一步研究。

腹瀉在犢牛中的發(fā)病率極高，導致犢牛腹瀉的原因有很多，主要的病原體有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、輪狀病毒等[8]。在治療疾病的過程中，雖然抗生素起到了重要作用，但在長期使用過程中抗生素易產生耐藥性。在本次犢牛腹瀉的病例中，由于沒有及時進行實驗室診斷，盲目使用多種藥物，造成了犢牛大量死亡。根據(jù)實驗室診斷結果，采用阿米卡星配合頭孢哌酮有效控制住了本病，不再有新的病例發(fā)生。因此，臨床治療本病時，建議先進行藥敏試驗，篩選出敏感藥物后再進行治療。為防止犢牛發(fā)生脫水，應及時補充5%葡萄糖生理鹽水，并在其中添加碳酸氫鈉，避免腹瀉引起的酸中毒。為保護胃腸道黏膜，可口服鞣酸蛋白或次硝酸鉍。經(jīng)過3～5d治療，即可有效控制犢牛死亡及新病例的出現(xiàn)。

大腸桿菌是一種條件性致病菌，只有在自身抵抗力弱時才會發(fā)病。這次犢牛嚴重腹瀉發(fā)生時，該地區(qū)出現(xiàn)降雪，加之壩上地區(qū)氣候寒冷，同時牛場環(huán)境相對較差，應激及飼養(yǎng)管理差是導致此次犢牛腹瀉的主要原因，因此，加強飼養(yǎng)管理是防治本病的重要措施。為了避免犢牛發(fā)生腹瀉，犢牛出生后應盡早吃食初乳，增強自身的抗病能力;避免犢牛受潮、受寒、飲用不潔的水;母牛妊娠期間給予豐富的蛋白質和維生素飼料，保持適當?shù)倪\動;做好接產工作，母牛分娩前后徹底清洗消毒;在大腸桿菌常發(fā)的地區(qū)，可以根據(jù)血清型制備油乳劑滅活疫苗，從而進行犢牛的免疫預防。只有采取綜合的防控措施，才能避免犢牛腹瀉的發(fā)生，提高養(yǎng)殖效益。

參考文獻

[1]荔霞，王勝義，劉永明，等.犢牛腹瀉病因及其藥物防治研究進展[J].中國畜牧醫(yī)，2010，37（10）：161-165.

[2]尚婷婷. 犢牛大腸桿菌病病原的分離鑒定及其診治[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[3]劉永彬.犢牛大腸桿菌病的病因和治療[J].今日畜牧獸醫(yī)，2017（05）：25.

[4]陳虹豆.2株致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J/OL].畜牧與飼料科學，2019（02）：108-112

[5]朱利霞，王洪彬，楊楠，等.水貂綠膿桿菌病研究概述[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（18）：214-217.

[6]翟晶晶，王珊，尹姣姣，等.兩株禽綠膿桿菌的分離鑒定與致病性研究[J].山西農業(yè)大學學報（自然科學版），2019，39（01）：107-112.

[7]彭德勛.犢牛綠膿桿菌腹瀉的診斷和防治報告[J].中國獸醫(yī)志，1989（08）：12-23.

[8]赫鳴睿.某牛場犢牛大腸桿菌病的實驗室診斷與藥敏試驗[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2019（01）：39-43.

（責編：張宏民）