溫書恒 ，田志嶺 ，張淼 ，張孟周 ，王帥 ，陳京偉 ，孫英富 ，王昌亮 ，4，趙銳 ，官大威

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110013；2.遼寧省智慧檢務(wù)創(chuàng)新研究院 智慧司法鑒定聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110122；3.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；4.遼寧省人民檢察院，遼寧 沈陽 110033）

在日常生活中，骨骼肌損傷的發(fā)生率較高。在法醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中對(duì)骨骼肌損傷愈合的研究有一定的科研價(jià)值。在法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)損傷時(shí)間的推斷一直是法醫(yī)學(xué)鑒定中需要解決的重要問題之一[1-2]。精確推斷損傷時(shí)間或縮小推測時(shí)間的范圍，可以對(duì)案件發(fā)生的時(shí)間、嫌疑人的確認(rèn)或排除提供重要的參考依據(jù)。因此更好地了解和掌握骨骼肌損傷愈合的一般過程，可以為法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間推斷提供參考依據(jù)。

研究結(jié)果[3]表明，骨骼肌損傷修復(fù)是一個(gè)受多因素調(diào)節(jié)的炎癥性組織愈合過程，可分為急性期、修復(fù)期和組織塑形期，全過程包括損傷肌纖維的壞死，炎癥細(xì)胞的募集，生肌細(xì)胞的激活、分化并融合為新的肌纖維，以及肌成纖維細(xì)胞形成纖維組織瘢痕[4-5]。目前，已知骨骼肌中有多種細(xì)胞具有肌源性潛能，其中衛(wèi)星細(xì)胞以往被認(rèn)為是骨骼肌修復(fù)再生過程中最重要的細(xì)胞[6-7]，近年來，研究的注意力投向了在嬰幼兒骨骼肌生長過程中不可或缺的周細(xì)胞[8-10]。

在骨骼肌中，周細(xì)胞參與構(gòu)成衛(wèi)星細(xì)胞的“鞘”結(jié)構(gòu)，不僅促進(jìn)其肌源性分化，還參與誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞的靜息狀態(tài)[11-12]。骨骼肌周細(xì)胞具有異質(zhì)性，尚無單一特異的標(biāo)記物，公認(rèn)的是神經(jīng)元膠原抗原2（neuron-glial antigen2，NG2）和血小板源性生長因子受體β（plateletderived growth factor receptor beta，PDGFRβ）[13-16]，NG2和PDGFRβ雙陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是周細(xì)胞，并可以將周細(xì)胞分為1型（nestin-GFP-/NG2/PDGFRβ陽性）和2型（nestin-GFP+/NG2/PDGFRβ陽性）兩個(gè)主要亞型[17-18]。在骨骼肌損傷和疾病中，周細(xì)胞可以自發(fā)地與成肌細(xì)胞融合形成肌管，有助于骨骼肌再生[19]。此外，文獻(xiàn)報(bào)道在骨骼肌損傷后，肌纖維基底膜下部分移植的周細(xì)胞可表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子（paired-box transcription factor，Pax7）蛋白[10]，這一現(xiàn)象與骨骼肌周細(xì)胞可以生成衛(wèi)星細(xì)胞的假設(shè)相印證[20]。目前，周細(xì)胞在肌肉組織損傷后是否具有時(shí)間規(guī)律性的表達(dá)尚不明確。

本課題組持續(xù)關(guān)注如2型大麻素受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）[21]、肌鈣蛋白Ⅰ（troponinⅠ）[22]、α7尼古丁乙酰膽堿受體（α7-nicotine acetylcholine receptor）[23]、Pax7及生肌決定因子（myoblast determination，MyoD）1[24]、同源域相互作用蛋白激酶2（homeodomain interacting protein kinase 2，HIPK2）[25]等指標(biāo)在皮膚和骨骼肌損傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用。本研究擬應(yīng)用雙重及三重免疫熒光染色等方法，研究在小鼠骨骼肌挫傷后周細(xì)胞的時(shí)間規(guī)律性表達(dá)，并初步探討其可能的作用，以期為法醫(yī)學(xué)的肌肉損傷時(shí)間推斷提供一個(gè)新的參考指標(biāo)，同時(shí)為肌肉損傷愈合的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作及分組

動(dòng)物模型的建立與操作遵照“中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理辦法”的標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）審查通過。根據(jù)本課題組前期小鼠骨骼肌挫傷模型建立方法[25]，取雄性C57B6/L小鼠40只，周齡8～10周，體質(zhì)量18.1～24.1g。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（350mg/kg）麻醉后，將小鼠右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，將質(zhì)量80 g的不銹鋼小球（直徑12mm）在高45cm處通過內(nèi)徑14mm的管道自由垂直落于打擊器上，打擊處于靜止?fàn)顟B(tài)的小鼠右后小腿腓腸肌中部，打擊器的打擊面積為28.26 mm2。挫傷后，各鼠分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜循環(huán)交替環(huán)境，墊料清潔及空氣通暢。

小鼠于挫傷后1、3、5、7、9、14、28d（各時(shí)間段5只小鼠）腹腔注射致死量的戊巴比妥鈉（350 mg/kg）。5只對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射致死量的戊巴比妥鈉（350mg/kg）。取小鼠右后肢腓腸肌用于組織病理學(xué)觀察。解剖證實(shí)骨骼肌損傷率達(dá)100%，且未見脛、腓骨骨折。

1.2 蘇木素-伊紅染色

取常規(guī)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化。由蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后在Olympus cellSens Entry 1.18顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）中觀察染色結(jié)果。

1.3 免疫熒光染色

1.3.1 NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

小鼠骨骼肌樣本經(jīng)4%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液（pH=7.4，phosphate buffer saline，PBS）固定后，進(jìn)行石蠟包埋，制作3μm厚組織病理學(xué)切片，通過NG2和PDGFRβ雙重免疫熒光染色進(jìn)行周細(xì)胞鑒定和定位檢測。組織病理學(xué)切片經(jīng)脫蠟、檸檬酸熱修復(fù)后，用5%驢正常非免疫血清（中國Solarbio Life Science公司）封閉。其后將切片與小鼠源性NG2單克隆抗體（MAB5384，德國Merck公司）和山羊源性PDGFRβ多克隆抗體［GT15065，安諾倫（北京）生物科技有限公司］經(jīng)抗體稀釋液（TA-125-ADQ，美國Thermo Fisher Scientific公司）稀釋（體積稀釋濃度均為1∶200）后，在4℃孵育過夜。Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG（1∶200，A-21202，美國Thermo Fisher Scientific公司）和Alexa Fluor?594驢抗山羊IgG（A-11055，美國Thermo Fisher Scientific公司）經(jīng)抗體稀釋液稀釋后（體積稀釋濃度均為1∶200）于室溫與切片孵育2h。應(yīng)用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚［4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI］染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。切片經(jīng)防熒光淬滅封片劑封片，并通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。切片以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，未見非特異染色。

1.3.2 NG2/PDGFRβ/Pax7和 NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色

為明確骨骼肌周細(xì)胞與衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)系，分別選取衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)的挫傷后1 d、挫傷后3d組的組織病理學(xué)切片，通過NG2、PDGFRβ、Pax7或NG2、PDGFRβ、MyoD1三重免疫熒光染色進(jìn)行周細(xì)胞與靜息或激活狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞的共定位檢測。組織病理學(xué)切片經(jīng)脫蠟、檸檬酸熱修復(fù)后，用5%驢正常非免疫血清封閉。其后小鼠源性NG2單克隆抗體、山羊源性PDGFRβ多克隆抗體和兔源性Pax7多克隆抗體（1∶200，ab187339，英國Abcam公司）或兔源性MyoD1多克隆抗體（1∶200，ab64159，英國Abcam公司）經(jīng)抗體稀釋液稀釋后與切片在4℃孵育過夜。然后，Alexa Fluor?488驢抗小鼠IgG（A-21202，美國Thermo Fisher Scientific公司）、Alexa Fluor?594驢抗山羊IgG和Alexa Fluor?647驢抗兔IgG經(jīng)抗體稀釋液稀釋（1∶200）后于室溫與切片孵育2 h。應(yīng)用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。切片經(jīng)防熒光淬滅封片劑封片，并通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。切片以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，未見非特異染色。

1.4 形態(tài)學(xué)測量分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在DMi8激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）×400倍鏡下，每張切片分別于挫傷中心區(qū)及周邊區(qū)各隨機(jī)選擇10個(gè)視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。挫傷周邊區(qū)限定為挫傷中心區(qū)邊界至其外200 μm范圍內(nèi)。對(duì)每個(gè)鏡下視野中的NG2/PDGFRβ陽性、NG2/PDGFRβ/Pax7陽性和NG2/PDGFRβMyoD1陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，10個(gè)隨機(jī)選擇視野的陽性細(xì)胞數(shù)取平均值以評(píng)估各挫傷樣本。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分析。

通過GraphPad Prism 6軟件，應(yīng)用比例檢驗(yàn)（ratio）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用獨(dú)立樣本單因子變異數(shù)分析（one-way ANOVA）對(duì)細(xì)胞數(shù)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)各組間細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

小鼠骨骼肌挫傷后，挫傷區(qū)內(nèi)可見組織出血、肌纖維水腫以及壞死等改變（圖1）。挫傷后1d，挫傷區(qū)內(nèi)可見大量分葉核細(xì)胞。圓形的單個(gè)核細(xì)胞在挫傷后1d出現(xiàn)，并在挫傷后3d數(shù)量增加。挫傷后3d，紡錘狀的成纖維樣細(xì)胞出現(xiàn)在挫傷區(qū)內(nèi)。挫傷后5～9 d，挫傷區(qū)內(nèi)可見大量多核新生肌管以及成纖維樣細(xì)胞。挫傷后14 d和28 d，新生肌管的核逐漸邊聚、數(shù)量逐漸減少，挫傷區(qū)內(nèi)仍可見少量成纖維樣細(xì)胞并伴隨膠原纖維沉積。

圖1 小鼠骨骼肌挫傷后組織病理學(xué)改變（HE×100）

2.2 NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

為檢測周細(xì)胞在挫傷后不同時(shí)間的狀態(tài)和數(shù)量變化情況，應(yīng)用周細(xì)胞標(biāo)記物NG2和PDGFRβ進(jìn)行雙重免疫熒光染色定位周細(xì)胞（圖2）。形態(tài)學(xué)上，與正常骨骼肌中細(xì)長形態(tài)的周細(xì)胞相比，挫傷后1d開始，挫傷區(qū)NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞體積增大、形態(tài)變圓，細(xì)胞核呈圓形，其中挫傷周邊區(qū)和中心區(qū)分別于挫傷后14 d和28 d可見恢復(fù)至正常細(xì)長形態(tài)的NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞。此外，挫傷后5～14d，挫傷中心區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ陽性的新生肌管（圖2A）。

圖2 小鼠骨骼肌挫傷后NG2/PDGFRβ雙重免疫熒光染色

經(jīng)分析檢驗(yàn)，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)與全挫傷區(qū)的NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞數(shù)量及NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比例在挫傷后各時(shí)間段均呈單峰分布（表1）。NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞數(shù)量在挫傷中心區(qū)于挫傷后5 d達(dá)到峰值（P＜0.05），挫傷周邊區(qū)于挫傷后5d和7d達(dá)到峰值（P＜0.05），全挫傷區(qū)于5、7、9d達(dá)到峰值（P＜0.05）。挫傷后28 d，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)及全挫傷區(qū)的NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞數(shù)量均仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比例在挫傷中心區(qū)于挫傷后5、7d達(dá)峰值（P＜0.05），挫傷周邊區(qū)于挫傷后7 d達(dá)到峰值（P＜0.05），全挫傷區(qū)于5、7、9d達(dá)到峰值（P＜0.05）。挫傷后28d，挫傷中心區(qū)、周邊區(qū)及全挫傷區(qū)NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比例與對(duì)照組相比差異均仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 NG2/PDGFRβ/Pax7和NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色

挫傷后1 d，挫傷區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ/Pax7陽性細(xì)胞，并可見少量NG2/PDGFRβ/MyoD1陽性細(xì)胞（圖3）；挫傷后3d，挫傷區(qū)可見大量NG2/PDGFRβ/MyoD1陽性細(xì)胞，并可見少量NG2/PDGFRβ/Pax7陽性細(xì)胞（圖4）。

表1 小鼠骨骼肌挫傷后各時(shí)間段NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞比例

圖3 挫傷后1d NG2/PDGFRβ/Pax7三重免疫熒光染色結(jié)果

圖4 挫傷后3d NG2/PDGFRβ/MyoD1三重免疫熒光染色結(jié)果

3 討 論

衛(wèi)星細(xì)胞被普遍認(rèn)為在骨骼肌再生中起主要作用[7]。已有研究[26]表明，肌肉損傷后處于靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被激活、增殖并向損傷區(qū)域遷移，最終與損傷的肌纖維相融合形成新生肌管，從而參與肌肉修復(fù)再生過程。骨骼肌周細(xì)胞更多被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞或其他生肌細(xì)胞的前體細(xì)胞[20]。而近年來的研究[15，18]逐漸揭示了周細(xì)胞在肌組織損傷后也會(huì)參與骨骼肌修復(fù)再生，并同時(shí)參與組織塑形期的膠原生成和纖維組織沉積過程。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌損傷后，肌纖維基底膜下小部分移植入體內(nèi)的周細(xì)胞表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物Pax7，提示損傷后部分骨骼肌周細(xì)胞可能會(huì)發(fā)揮衛(wèi)星細(xì)胞的功能。體外實(shí)驗(yàn)[9-10]證實(shí)，骨骼肌周細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中可形成肌管，生成肌纖維；在體實(shí)驗(yàn)中，移植入體內(nèi)損傷區(qū)域的周細(xì)胞可以增殖生成肌纖維而參與肌肉修復(fù)再生過程。從本研究得到的挫傷后骨骼肌周細(xì)胞的表達(dá)情況來看，挫傷后1d，部分周細(xì)胞表達(dá)靜息狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物Pax7，挫傷后3d也有部分周細(xì)胞表達(dá)激活狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物組織病理學(xué)切片，與周細(xì)胞在骨骼肌損傷后可以發(fā)揮衛(wèi)星細(xì)胞功能的研究發(fā)現(xiàn)相互印證，并進(jìn)一步提示周細(xì)胞的作用可能還包含了募集和激活衛(wèi)星細(xì)胞并參與骨骼肌再生和修復(fù)的過程。而挫傷后5d可觀察到有表達(dá)周細(xì)胞標(biāo)記物的新生肌管，這與前述骨骼肌周細(xì)胞可以生成肌管的發(fā)現(xiàn)相一致，提示了周細(xì)胞在肌肉再生過程中除起到前體細(xì)胞的輔助作用之外，可能還參與生肌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，挫傷中心區(qū)和挫傷周邊區(qū)的周細(xì)胞數(shù)量和周細(xì)胞與所有細(xì)胞的比例在骨骼肌損傷后的急性期、修復(fù)期和組織塑形期過程中均有明顯增加，提示在骨骼肌損傷修復(fù)的全過程中，周細(xì)胞均參與并發(fā)揮作用。此外，挫傷中心區(qū)在挫傷后28d可見形態(tài)恢復(fù)至正常細(xì)長狀的周細(xì)胞，而挫傷周邊區(qū)則在挫傷后14d觀察到恢復(fù)至正常形態(tài)的周細(xì)胞，結(jié)合挫傷中心區(qū)在挫傷后28d仍處于修復(fù)期和組織塑形期，而挫傷周邊區(qū)則在挫傷后14d基本完成了骨骼肌修復(fù)再生過程。因此，挫傷中心區(qū)與挫傷周邊區(qū)周細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)時(shí)間的差異，提示骨骼肌周細(xì)胞的形態(tài)改變與其參與組織修復(fù)過程相關(guān)。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，大多數(shù)研究應(yīng)用較為簡便的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行損傷時(shí)間判定[1，27]。本研究采用雙重免疫熒光染色共定位法對(duì)小鼠骨骼肌挫傷后周細(xì)胞表達(dá)的時(shí)間規(guī)律性進(jìn)行了觀察。結(jié)合本研究結(jié)果，小鼠骨骼肌挫傷中心區(qū)、挫傷周邊區(qū)及全挫傷區(qū)的周細(xì)胞（NG2/PDGFRβ陽性細(xì)胞）數(shù)量、周細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比例均在挫傷后有時(shí)間規(guī)律性表達(dá)，且在挫傷后特定的時(shí)間范圍（3～9 d、5～7 d、14～28 d）及時(shí)間點(diǎn)（5、7d）存在人體肌肉損傷時(shí)間推斷的潛在參考意義，有可能在中長期肌肉損傷時(shí)間推斷中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究表明小鼠骨骼肌挫傷后，部分周細(xì)胞表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物，部分新生肌管也表達(dá)周細(xì)胞標(biāo)記物，提示周細(xì)胞參與骨骼肌損傷后的肌肉修復(fù)再生過程。挫傷區(qū)周細(xì)胞的數(shù)量變化具有一定的時(shí)間規(guī)律性，提示其可能作為肌肉損傷時(shí)間推斷的一個(gè)參考指標(biāo)。