浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

痛風是由體內嘌呤代謝紊亂導致尿酸生成增多和（或）尿酸排泄減少所引起的一種慢性低毒性炎癥反應性疾病，特征為尿酸鹽沉積，表現(xiàn)為關節(jié)紅腫、疼痛，并發(fā)痛風石沉積、關節(jié)畸形、腎功能不全等癥狀，嚴重危害人們健康。研究表明，沉積的尿酸鹽結晶被固有免疫識別受體結合后能夠啟動寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥信號通路，從而刺激機體產生炎癥因子，介導炎癥反應[1]。臨床治療藥物如秋水仙堿，可作用于NLRP3炎癥信號通路治療痛風，但存在較大的不良反應[2]，因此新藥物的開發(fā)仍是痛風研究的熱點。某些抗炎中藥能夠有效防治痛風性關節(jié)炎，而且成分天然、不良反應少，引起了研究者的廣泛關注[3]。

既往研究證實，痛風性關節(jié)炎模型小鼠的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、NLRP3、天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶-1 （cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量增加[4]。邢志華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物葛根素可防治痛風性關節(jié)炎。進一步研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮總黃酮可通過抑制NLRP3炎癥信號表達，降低炎癥效應[6]。以上實驗研究的結果，與含黃酮類成分的中藥具有清熱祛濕、化瘀通絡的功效相呼應，因此，筆者推測含有黃酮成分的中藥可能是治療痛風性關節(jié)炎的潛在新藥[7]。中藥的抗炎作用具有多靶多效的特點，但是其組成成分復雜，靶標關聯(lián)不明確，導致在分子水平研究中藥抗炎機制的報道較少。而以計算機軟件為基礎的分子對接技術可立足于中藥已知成分，將中藥成分和炎癥蛋白進行模擬對接，推測藥物作用機制，該項技術已被廣泛應用于中藥抗炎活性成分的篩選和作用靶標的確定[8]。本文利用分子對接技術，以山核桃葉總黃酮中的5種主要單體漢黃芩素、白楊素、小豆蔻明、球松素查爾酮、松屬素[9]為配體，與NLRP3炎癥通路信號蛋白進行半柔性對接，研究山核桃葉黃酮單體對NLRP3炎性體及其通路信號的作用靶點，明確山核桃葉黃酮單體抗痛風藥效的物質基礎及作用機制，為痛風性關節(jié)炎提供藥物治療的新方向。

1 材料和方法

1.1 黃酮配體收集與建立 利用軟件ChemBioDraw構建山核桃葉總黃酮中各單體的平面結構：小豆蔻明（cardamonin）、白楊素（chrysin）、松屬素（pinocembrin）、球松素查爾酮（pinostrobin Chalcone）、漢黃芩素（wogonin），結構式如圖1所示。將其保存為CDX文件，導入軟件ChemBio3D中呈現(xiàn)其三維立體結構，利用分子力場MM2簡單優(yōu)化后設置動力學模擬參數(shù)進一步優(yōu)化，并對優(yōu)化后的分子進行類藥性質分析。

圖1 5種黃酮單體的化學結構式Fig.1 Chemical structure of five flavonoids monomers

1.2 蛋白受體收集與建立 查閱文獻，收集與NLRP3通路相關的報道，了解到NLRP3信號傳遞不僅和NLRP3炎性體有關，還與鉀鈣離子濃度、細胞表面嘌呤受體P2X配體門控的離子通道7（purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7，P2X7）、乙?；⒐艿鞍?、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、花生四烯酸代謝等路徑存在聯(lián)系，最終確定了22個與NLRP3信號通路相關的蛋白，從RCSB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）中篩選對應的人源受體靶點蛋白[10]。見表1。

1.3 分子對接流程 利用軟件Discovery Studio 2.5預處理靶蛋白，處理完畢后以PDB格式存儲，得到半柔性蛋白。用軟件Auto Dock進行分子對接，先后導入經ChemBio3D處理的山核桃葉黃酮單體以及經Discovery Studio 2.5預處理的靶點蛋白。

1.3.1 參數(shù)文件準備 使用AutoGrid 4.0進行能量格點計算，將靶點蛋白（macromolecule）設置為中心坐標（center），使Gird Box網格區(qū)域覆蓋所研究的靶點蛋白。使用AutoDock 4.0搜索網格范圍內對接區(qū)域，采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian GA 4.2）進行區(qū)域搜索，初始種群數(shù)設置為150，能量評定最大次數(shù)為2 500 000，每個小分子配體都設定得到20個構象，其他參數(shù)選擇默認值。

表1 人源受體靶點蛋白信息Tab.1 Information of human receptor target proteins

1.3.2 分子對接計算 采用AutoGrid 4.0計算格點中相關能量，運行AutoDock 4.0進行區(qū)域搜索，進行半柔性對接，并對結果進行聚類分析。因篇幅限制，以結合能（binding energy，BE）作為輔助判斷，篩選出抑制常數(shù)（inhib constant，IC）小于10的靶點蛋白，并將最佳構象導入軟件PyMOL，呈現(xiàn)復合物構象，分析觀察山核桃葉黃酮單體與NLRP3炎癥信號蛋白的結合情況。

2 結果

2.1 山核桃葉黃酮單體的類藥性質 經動力學優(yōu)化后，山核桃葉黃酮單體小豆蔻明、白楊素、松屬素、球松素查爾酮和漢黃芩素的類藥五性質（相對分子質量、可旋轉鍵數(shù)、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目和脂水分配系數(shù)）數(shù)據(jù)見表2。

2.2 靶點蛋白篩選 半柔性對接后，篩選出IC小于10的靶點蛋白，靶點蛋白與山核桃葉黃酮單體小豆蔻明、白楊素、松屬素、球松素查爾酮和漢黃芩素相互作用的BE、IC、氫鍵組成原子及其鍵長和鍵角等相關信息見表3。

2.3 靶標分析 對接結果顯示，N-乙?；D移酶與多種黃酮單體對接較好，可能為黃酮單體治療痛風性關節(jié)炎的共同作用位點，進一步將N-乙?；D移酶與多種黃酮單體進行對接的終末文件導入PyMOL軟 件，分析對接結果的三維結構。見圖2。

表2 山核桃葉黃酮單體的類藥性質Tab.2 Drug-like properties of flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-1 靶點蛋白與山核桃葉黃酮單體對接結果及相互作用Tab.3-1 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-2 靶點蛋白與山核桃葉黃酮單體對接結果及相互作用Tab.3-2 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

圖2 黃酮單體與N-乙酰基轉移酶作用Fig.2 Interaction between flavonoids monomers and N-acetyltransferase

3 討論

大量研究表明，關節(jié)腔中析出的尿酸鹽結晶可刺激NLRP3中C端的LRR，使N端PYD募集ASC和caspase-1，形成NLRP3炎性體，寡聚化后活化caspase-1，酶解IL-1β前體，釋放成熟的IL-1β，從而介導炎癥反應的發(fā)生[11-12]。正常情況下，NLRP3被HSP90、SGT1抑制，處于靜止狀態(tài)，而尿酸鹽沉積后不僅可通過刺激細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶，使TXNIP脫離TRX，氧化線粒體DNA，以此激活NLRP3炎性體，還能在乙?；⒐艿鞍椎膮⑴c下，刺激單核-巨噬細胞表達NLRP3炎性體。有研究表明，細胞膜表面的P2X7可通過影響細胞鉀離子平衡，激活NLRP3炎性體[13-14]。

依據(jù)對接結果，本研究提示，山核桃葉黃酮單體可作用于NLRP3炎癥通路的多個靶點，且抗痛風性關節(jié)炎的作用機制存在差異。按IC排序，依次是小豆蔻明、球松素查爾酮、漢黃芩素、白楊素和松屬素。小豆蔻明阻斷NLRP3炎性體激活及其信號傳遞可能與抑制N-乙?；D移酶-2、TXNIP和caspase-1的活性，以及抑制核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的釋放，抑制NLRP3炎性體（LRR）激活、影響花生四烯酸代謝等有關。球松素查爾酮的生物活性可能主要是抑制花生四烯酸代謝，抑制HSP和TRX2的活性，以及抑制pro-caspase-1酶解，同時可能參與調節(jié)細胞鉀離子濃度失控。漢黃芩素可能阻斷NLRP3炎性體（PYD）活化，抑制N-乙?；D移酶-1活性以及caspase-1前體的酶解，以及阻斷IL-1R與配體的結合。白楊素主要抑制N-乙酰基轉移酶-2、N-乙?；D移酶-1、caspase-1和HSP的活性，以及阻斷NLRP3炎性體（PYD）的活化。松屬素可能抑制NLRP3炎性體（LRR）激活，抑制N-乙?；D移酶-2、N-乙?；D移酶-1、TRX2和TXNIP的活性，以及抑制IL-1R與配體結合。

據(jù)研究報道，黃酮類中藥提取物可降低由尿酸鹽沉積引起的痛風小鼠關節(jié)腫脹度，并減少滑膜組織NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白表達，提示黃酮類中藥可抑制NLRP3炎性體軸表達[15-16]，此與本實驗分子對接的結果一致。在糖尿病治療研究中，黃酮類藥物還可提高鈉-鉀-ATP酶活性，向細胞內泵入鉀離子，由此調節(jié)細胞內的離子濃度[17]，從而緩解由尿酸鹽引起的細胞鉀離子流失，抑制NLRP3炎性體的激活。N-乙?；D移酶參與微管蛋白對NLRP3的排列和激活，且有報道證實其與藥物性肝傷害及炎癥密切相關[18]，本實驗分子對接結果顯示，其與多種黃酮單體對接較好，提示黃酮通過活性基團羥基和羰基抑制微管蛋白乙酰化，從而阻止其對NLRP3的激活，并緩解藥物性肝損傷及炎癥反應，與現(xiàn)有報道天然黃酮可治療化學性肝損傷并能抑制炎癥反應一致[19]。

NLRP3炎性體與心血管疾病密不可分，有學者在研究中藥黃酮類提取物對動脈粥樣硬化的治療作用時發(fā)現(xiàn)，藥物中的各黃酮單體之間可能存在協(xié)同作用，以此增加抗炎效果[20-21]。也有研究發(fā)現(xiàn)山核桃葉黃酮單體能夠作用于Toll/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88） 通路，抑制NF-κB釋放，減少炎癥因子的表達從而可以防治痛風性關節(jié)炎[22]。此外，黃酮類藥物在治療缺血再灌注損傷時可抑制一氧化氮合酶活性，從而起到抗氧化作用，其中羥基作為取代基發(fā)揮抗氧化活性，不僅可電離出氫原子中和氧自由基，還能抑制花生四烯酸代謝酶及其代謝產物的活性，從而保護機體免受氧化損傷[23-25]。

中藥黃酮成分天然、多靶多效，可作為痛風性關節(jié)炎治療藥物的研究方向。本研究借助分子對接技術模擬并探討了山核桃葉黃酮單體成分抗痛風性關節(jié)炎的作用機制，發(fā)現(xiàn)山核桃葉提取物中5種主要黃酮單體可通過多途徑抑制NLRP3炎性體的激活和信號傳遞，且各單體均與N-乙?；D移酶結合較好，可作為抗痛風藥物研究的新方向。從中藥中篩選抗痛風性關節(jié)炎的活性單體，研究其作用靶點和機制，是目前研究天然藥物防治痛風性關節(jié)炎的熱點。分子對接技術可構建藥效物質-作用靶點關系，發(fā)掘中藥藥效基礎及其抗炎機制，為探索治療痛風性關節(jié)炎的活性成分、治療靶點等提供參考。但本文只在理論上預測了山核桃葉黃酮單體對痛風性關節(jié)炎NLRP3炎癥信號通路的作用機制，準確度較低，需進一步對預測結果進行實際驗證，使研究結論更具科學性。