瞿思穎 邰昭霞 費雪瑜 邵曉梅,3 何曉芬,3 方劍喬,3 蔣永亮,3

1.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江省針灸神經病學研究重點實驗室 3.浙江中醫(yī)藥大學針灸研究所

糖尿病具有多種并發(fā)癥，糖尿病神經痛（diabetic neuropathic pain，DNP）就是其中一種，其發(fā)病率很高[1]，嚴重影響患者生存質量，目前藥物治療方案有限，而且療效不佳。DNP常表現(xiàn)為痛覺敏化[2]，其中中樞敏化是DNP發(fā)生、維持的主要機制之一，主要涉及脊髓背角神經元的超興奮性。有研究表明，星形膠質細胞在DNP的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3]，已成為治療DNP的重要靶點，而星形膠質細胞活化的重要標志物之一為膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。也有研究表明，脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA）受體2B亞基磷酸化（phospho-N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B subunit，p-NR2B）與 DNP 的產生與維持相關[4]。

針刺是控制慢性疼痛的主要手段之一，臨床隨機對照研究證實針刺或電針（electroacupuncture，EA）可有效控制DNP[5-7]。已有研究表明，低頻EA干預DNP優(yōu)于高頻[8]，但是其具體機制有待進一步明確。本實驗通過建立DNP大鼠模型，觀察大鼠L4～L6脊髓背角星形膠質細胞活化情況及p-NR2B表達的變化，為應用EA干預DNP提供重要的科學依據(jù)與理論闡釋。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠26只購于中國科學院上海實驗動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，35 周齡，體質量（135±15）g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。正常組大鼠予以嚙齒類動物標準顆粒飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼養(yǎng)組予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，均自由飲水。飼養(yǎng)室溫度維持在（24±2）℃，12h燈光晝夜循環(huán)。

1.2 主要儀器與試劑 HANS 200E型韓氏穴位神經刺激儀購于北京華衛(wèi)產業(yè)開發(fā)公司；37450型動態(tài)足底觸覺儀為意大利Ugo Basile公司產品；激光共聚焦顯微鏡購于日本Nikon公司。兔抗大鼠GFAP多克隆抗體購于美國abcam公司（批號：GR154650-5）；兔抗大鼠p-NR2B抗體購于美國GeneTex公司（批號：821502001）；驢抗兔 Alexa Fluor488 IgG（H+L）二抗購于美國Jackson Immunolab公司（批號：138271）。

1.3 造模與分組 以完全隨機分組法將大鼠分為正常組（6只）與高脂高糖飼養(yǎng)組（20只）。正常組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼養(yǎng)組大鼠予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)5周，繼以腹腔注射35mg/kg的鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），正常組給予相同劑量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射3d后檢測空腹血糖，血糖穩(wěn)定且≥11.1mmol·L-1的大鼠入選實驗。2周后檢測大鼠的機械痛閾，血糖升高和痛閾下降作為DNP模型造模成功的標準。高脂高糖飼養(yǎng)組大鼠中2只死亡，4只血糖未升高，2只痛閾未下降，最終造模成功的大鼠共12只。將造模成功的大鼠分為DNP模型組和EA組，每組6只。

1.4 EA干預 造模成功后開始EA干預，采用0.25mm×13mm的毫針，選用雙側“足三里”“昆侖”穴，進針后連接韓氏穴位神經刺激儀。電針參數(shù)：頻率2Hz，強度1mA，干預 15min；2mA 干預 15min，共 30min，1 次/d，持續(xù)1周。

1.5 痛閾測定 采用動態(tài)足底觸覺儀檢測大鼠機械縮足反射閾值（paw withdrawal threshold，PWT）[9]。分別于造模前、造模后5、7和8周進行檢測，測量前將大鼠置于塑料盒內適應環(huán)境20min，待大鼠安靜后，用金屬絲對大鼠足底給予機械刺激。刺激力量從0g開始，以2.5g/s的速度遞增，最大刺激力量為50g，避免大鼠足底受傷。共檢測5次，每次檢測間隔5min，去掉最大值和最小值，取余下3次的平均值。

1.6 免疫熒光檢測大鼠腰段脊髓背角GFAP、p-NR2B陽性細胞表達 大鼠經10%水合氯醛（0.35mL/100g）腹腔麻醉后，以4℃的0.9%氯化鈉溶液經左心室、升主動脈快速灌注，再以4%多聚甲醛灌注后快速分離脊髓L4～L6節(jié)段。將脊髓置于4%多聚甲醛溶液中固定6h，經15%和30%的蔗糖溶液梯度脫水，液氮快速冷凍后，行30μm冰凍切片。脊髓切片以TBST漂洗5min，漂洗3次后，轉入24孔板，加入10%驢血清，37℃孵育1h。分別加入以含10%驢血清的TBST稀釋的兔抗大鼠GFAP抗體（稀釋比例1：1 000）和含10%驢血清的TBST稀釋的兔抗大鼠p-NR2B抗體（稀釋比例 1：400）。4℃過夜后，TBST 漂洗切片 10min，共漂洗3次，加入含10%驢血清的TBST稀釋的Alexa Fluor488驢抗兔IgG二抗（稀釋比例1：400）進行免疫熒光標記，37℃避光孵育1h，TBST清洗3次。將脊髓切片轉移至黏附載玻片上，晾干后滴加抗熒光淬滅封片液，以蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍片。每只大鼠選用3張脊髓切片，采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)對腰段脊髓背角淺層陽性細胞表達率進行統(tǒng)計。陽性細胞表達率（%）=脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層陽性像素點/脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層總像素點×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠PWT比較 造模前各組大鼠PWT差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），造模第5周高脂高糖飼養(yǎng)后STZ注射前，各組大鼠PWT差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。造模后第7周，與正常組比較，DNP模型組和EA組大鼠PWT明顯下降（P＜0.01）。造模后第8周，與正常組比較，DNP模型組大鼠PWT明顯下降（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠PWT明顯升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠PWT比較Fig.1 Comparison of PWT in each group

2.2 各組大鼠腰段脊髓背角GFAP表達比較 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性細胞見圖2。與正常組比較，DNP模型組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性表達率明顯升高（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性細胞表達率明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性細胞（100×，標尺：100μm）Fig.2 GFAP positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×,scale bar：100μm)

圖3 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性細胞表達率比較Fig.3 Comparison of positive ratio of GFAP in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

從細胞形態(tài)學角度觀察，正常組大鼠脊髓背角星形膠質細胞呈分支狀，細胞胞體小，分支長而細，處于靜息狀態(tài)；DNP模型組大鼠脊髓背角星形膠質細胞胞體變大，分支變短，處于激活狀態(tài)，EA組大鼠星形膠質細胞雖處于激活狀態(tài)，但胞體較小。見圖4。

圖4 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層GFAP陽性細胞形態(tài)Fig.4 Morphology of GFAP positive cell in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

2.3 各組大鼠腰段脊髓背角p-NR2B表達比較 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層p-NR2B陽性細胞見圖5。與正常組比較，DNP模型組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層p-NR2B陽性細胞表達率明顯升高（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層p-NR2B陽性細胞表達率明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖5 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層p-NR2B陽性細胞（100×，標尺：100μm）Fig.5 P-NR2B positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×;scale bar：100μm)

圖6 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層p-NR2B陽性細胞表達率比較Fig.6 Comparison of positive ratio of p-NR2B in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

3 討論

近年來，糖尿病患者數(shù)量急劇上升，糖尿病并發(fā)癥已成為糖尿病患者主要死因之一，嚴重威脅著人類的健康，由此產生的醫(yī)療費用也給個人和社會經濟等帶來了沉重的負擔[10]。臨床上大約50%的糖尿病患者合并DNP，而DNP是糖尿病周圍神經病變中較為嚴重的一種[1]。

研究證實，DNP主要表現(xiàn)為痛覺敏化[11]，而中樞敏化是DNP發(fā)生、維持的關鍵機制，涉及脊髓背角神經元的超興奮性。星形膠質細胞是興奮性神經遞質代謝的重要場所之一，很多細胞因子和生長因子從激活的星形膠質細胞釋放，導致細胞周圍的化學環(huán)境改變，引發(fā)中樞敏化。然而，以神經細胞為作用靶點的藥物療法效果常常不夠理想。GFAP是星形膠質細胞活化的標志物之一。多種疼痛動物模型中均可觀察到脊髓星形膠質細胞的活化增殖反應和其特征性標志物GFAP的表達增加[12-13]。還有研究證實，疼痛模型中伴有星形膠質細胞的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞聚集、胞體變大、分支變多、GFAP灰度值增強等[14]。Liddelow等[15]發(fā)現(xiàn)，疾病狀態(tài)下靜息的星形膠質細胞會轉變?yōu)榫哂猩窠浂拘缘腁1表型，后者可以產生大量的炎癥因子。注射星形膠質細胞抑制劑氟代檸檬酸能明顯減輕由神經損傷和炎癥因素引起的痛覺過敏和異常性疼痛[16-17]。以上研究提示星形膠質細胞在神經病理性疼痛發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

NMDA受體是以谷氨酸為神經遞質的離子型受體，其中NR2B是NMDA受體的調節(jié)亞基，在脊髓背角呈選擇性高表達。有研究表明，鞘內注射NMDA受體NR2B亞基特異性拮抗劑艾芬地爾治療神經痛時，脊髓背角NR2B亞基的表達明顯降低，提示脊髓背角NR2B亞基參與神經痛的形成[18]。NR2B亞基磷酸化會影響NMDA受體的數(shù)量及功能，從而參與中樞敏化[19]。也有研究表明，脊髓背角NR2B亞基的表達量與DNP的產生與維持相關[4,20]。Wang等[21]研究表明，NMDA受體的亞基NR2B的表達與星形膠質細胞的活化有著密切的關系。有報道證實，EA可通過抑制脊髓背角NR2B亞基表達，從而提高神經病理性疼痛或炎性疼痛模型的痛閾[22-23]。也有研究表明，EA通過抑制脊髓背角GFAP活化對神經病理性疼痛產生鎮(zhèn)痛作用[24]。

本實驗通過高脂高糖飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ誘導DNP大鼠模型，初步探討了EA對DNP模型大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化和p-NR2B表達的影響。結果表明，EA可提高DNP大鼠PWT，免疫熒光顯示DNP模型組大鼠脊髓背角星形膠質細胞表達明顯增多，并且處于高度活化狀態(tài)；EA可明顯抑制DNP模型大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化，并且能抑制脊髓背角p-NR2B的表達。綜上所述，EA對DNP大鼠具有鎮(zhèn)痛作用，其可能的機制是抑制脊髓背角星形膠質細胞活化和p-NR2B的表達。在未來的研究中將采用免疫熒光雙標法檢測GFAP和p-NR2B的共表達，并通過GFAP和NR2B的特異性激動劑的鞘內注射，進一步觀察其對針刺鎮(zhèn)痛效應的影響。