王蓮芝 張春蕾 張晶 李瑩瑩 江暉 郎臨川 孫珺 崔嵐巍 紀濱英

兒童結(jié)核病疫情嚴重，發(fā)病率、死亡率居高不下。2014年WHO[1]“Guidancefornationaltuberculosisprogrammesonthemanagementoftuberculosisinchildren”第2版出版，同時從戰(zhàn)略上提出了“全球兒童結(jié)核病零死亡率”藍圖。但是由于兒童結(jié)核病癥狀不典型、取得病原學(xué)診斷依據(jù)困難等原因，常常導(dǎo)致延誤診斷、延誤治療，“零死亡率”面臨巨大的挑戰(zhàn)。尋求簡單、快速、靈敏的檢測方法，快速診斷、精準治療是兒童結(jié)核病防治亟需解決的關(guān)鍵問題。本研究應(yīng)用熒光涂片顯微鏡檢(簡稱“涂片檢查”)、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)和GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)3種方法檢測患兒晨起空腹胃液，探究GeneXpert檢測胃液中結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥的效能，旨在為兒童肺結(jié)核的診斷和治療提供有力的支持。

對象和方法

一、研究對象

搜集哈爾濱市胸科醫(yī)院兒童結(jié)核科、哈爾濱市兒童醫(yī)院呼吸科、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科2017年9月至2018年12月收治的2個月至14周歲疑似肺結(jié)核患兒155例，平均年齡(6.8±1.6)歲，男88例，女67例。155例疑似肺結(jié)核患兒均為HIV檢測陰性、未經(jīng)抗結(jié)核藥物治療且資料完整者。最后臨床診斷肺結(jié)核患者115例，非肺結(jié)核患者40例(包括細菌性肺炎21例，支原體肺炎14例，過敏性肺炎2例，肺隱球菌病1例，先天性肺囊腫2例)。

二、肺結(jié)核診斷與排除標準

1.肺結(jié)核診斷標準：兒童肺結(jié)核診斷標準參考《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[2]，均為臨床診斷。同時具備以下4條：(1)有呼吸系統(tǒng)癥狀、全身結(jié)核中毒癥狀或發(fā)育遲緩；(2)符合肺結(jié)核影像學(xué)特點；(3)結(jié)核菌素皮膚試驗結(jié)果顯示中度陽性或強陽性或γ干擾素釋放試驗陽性；(4)排除其他肺部疾病。

2.肺結(jié)核排除標準：(1)肺部病變經(jīng)應(yīng)用抗生素(非抗結(jié)核藥物)治療吸收；(2)結(jié)核菌素皮膚試驗和γ干擾素釋放試驗均陰性。符合以上任一條即排除。

三、儀器和試劑

熒光顯微鏡BX41(購自日本奧林巴斯株式會社)，熒光染色液和抗酸染色液(購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，全自動BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)、MGIT液體培養(yǎng)管和添加劑(購自美國BD公司)，GeneXpert 16模塊擴增檢測儀及MTB/RIF試劑盒(購自美國Cepheid公司)，MPB64蛋白抗原試劑盒(購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)，羅氏藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)試劑盒(購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

四、實驗方法

155例患兒全部于晨起空腹(禁食水4 h以上)抽取胃液至少2～3 ml，置于普通的樣本瓶內(nèi)，胃液收集后4 h內(nèi)可直接送檢，超過4 h需加入100 mg碳酸鈉中和胃酸。本研究獲得本院倫理委員會的批準，155例患者均簽署知情同意書。

1.標本前處理：將送檢的胃液放入50 ml螺口離心管中，3000×g離心15 min，棄上清，加入2.5 ml生理鹽水混勻，取0.5 ml用于涂片檢查，剩余2 ml分為2份，分別做MGIT 960和GeneXpert檢測。

2.涂片檢查：取0.5 ml前處理標本，于玻片正面右側(cè)2/3處均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形膜，自然干燥。染色前加熱固定。染色及鏡檢具體操作步驟和判讀標準參見《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]。

3.MGIT 960法：取1 ml前處理標本加入1 ml 4% 氫氧化鈉混勻，靜止15 min，加入磷酸緩沖液20 ml,3000×g離心15 min；棄上清，沉淀用0.5 ml磷酸緩沖液混勻后，全部加入有分枝桿菌培養(yǎng)營養(yǎng)添加劑的液體培養(yǎng)管中，混勻后放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng),儀器培養(yǎng)報陽后取培養(yǎng)后的菌液行萋-尼抗酸染色,確認是否為抗酸桿菌,然后行MTB菌種鑒定；經(jīng)鑒定為MTB后，進行藥敏試驗。

4.GeneXpert法：采用美國 Cepheid公司生產(chǎn)的GeneXpert檢測試劑盒及 GeneXpert全自動檢測平臺,嚴格按照操作規(guī)程對標本進行前處理后進行自動化檢測及結(jié)果判定。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以“率(%)”表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以臨床診斷為標準，評價GeneXpert法的檢測效能；采用Kappa檢驗，分析GeneXpert法與MGIT 960法藥敏試驗的一致性，Kappa值>0.75為一致性較好，Kappa值<0.40為一致性較差，0.40

結(jié) 果

一、3種方法檢測胃液中MTB的效能比較

以臨床診斷為標準，涂片檢查、MGIT 960法、GeneXpert檢測胃液中MTB的敏感度分別為30.4%(35/115)、54.8%(63/115)、69.6%(80/115)，特異度分別為95.0%(38/40)、100.0%(40/40)、97.5%(39/40)，見表1。

二、GeneXpert對不同類型患者的檢測效能

115例臨床診斷為肺結(jié)核的患兒標本中，涂陽培陽30例，GeneXpert檢測陽性29例，檢出率為96.7%；涂陰培陽33例，GeneXpert檢測陽性27例，檢出率為81.8%；涂陰培陰47例，GeneXpert檢測陽性19例，檢出率為40.4%；涂陽培陰5例，GeneXpert檢測陽性 5例。患兒為涂陽、涂陰、培陰時GeneXpert法檢測的陽性率分別為97.1%(34/35)、57.5%(46/80)、46.2%(24/52)，以MGIT 960法為標準，GeneXpert法檢測的敏感度為88.9%(56/63)。

表1 以臨床診斷為標準3種方法的檢測效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

三、MTB利福平耐藥性檢測效能評價

115例臨床診斷的肺結(jié)核患兒，MGIT 960法檢測陽性63例，其中有56例GeneXpert檢測也為陽性，7例GeneXpert檢測陰性；56例兩種方法檢測均陽性的患兒中，MGIT 960藥敏試驗結(jié)果顯示利福平耐藥11例，利福平敏感45例。而GeneXpert檢測利福平耐藥13例，利福平敏感43例；有2例患兒MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為敏感，而GeneXpert檢測為耐藥。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為參考標準，GeneXpert檢測MTB對利福平耐藥的敏感度為100.0% (11/11)，特異度為 95.6%(43/45)，與MGIT 960藥敏試驗結(jié)果具有較好的一致性(Kappa值=0.894)。

討 論

WHO[4]報告2017年兒童新發(fā)結(jié)核病患者101萬例，占新發(fā)結(jié)核病患者例數(shù)的10%，死亡23.4萬例；結(jié)核病患兒中耐多藥結(jié)核病約占3.2%[1]，疫情較為嚴重。肺結(jié)核是兒童結(jié)核病的主要類型，約占70%～80%，由于臨床癥狀不典型、排痰取痰困難、痰液載菌量低，且涂片檢測的敏感度低、培養(yǎng)耗時較長，導(dǎo)致肺結(jié)核患兒早期獲取病原學(xué)診斷十分困難。有文獻報道，20%～47%培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患兒在未治療時已轉(zhuǎn)院或失訪[5]，這對疫情控制十分不利。

GeneXpert法是近年結(jié)核病領(lǐng)域的研究熱點，是美國Cepheid開發(fā)的GeneXpert全自動一體化熒光定量PCR儀專用的MTB檢測試劑盒，將樣品的超聲破碎、核酸提取、樣品擴增、實時檢測融于一體，能在2 h內(nèi)直接檢出標本中是否含有MTB及該菌是否對利福平耐藥，其在成人肺結(jié)核中的診斷價值已得到部分研究證實[6-8]。雖然WHO已推薦GeneXpert法用于兒童結(jié)核病的診斷，但在不同標本中其檢測結(jié)果差異較大，且缺乏大量有效的研究證實。兒童咳嗽反射弱，排痰量少，經(jīng)常將呼吸道分泌物直接下咽；嬰幼兒在入睡時，呼吸道的纖毛運動將含有MTB的痰液送至喉部，然后吞咽至胃內(nèi)，在整個夜間會咽下大量呼吸道分泌物，而且夜間胃液分泌量明顯減少，因此胃液被認為是較好的診斷兒童肺結(jié)核的標本類型[9]。檢測胃液的敏感度高于誘導(dǎo)痰、支氣管鏡刷液、鼻咽吸取物和糞便標本[10-12]。Lu等[13]報道收集臨床確診的結(jié)核病患兒的痰液、胃液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和腦脊液等標本進行檢測，胃液的陽性率最高。即使是在涂陰肺結(jié)核患兒中，GeneXpert法檢測胃液的敏感度也達到了48.6%[14]，充分肯定了肺結(jié)核患兒檢測胃液的優(yōu)勢。

本研究以臨床診斷為標準，應(yīng)用涂片檢查、MGIT 960法和GeneXpert法3種方法檢測胃液中的MTB，GeneXpert法檢測的敏感度為69.6%，特異度為97.5%，敏感度明顯高于其他2種方法，這一結(jié)果與國內(nèi)外的諸多報道一致[15-17]。國內(nèi)張愛梅等[18]報道，對于臨床診斷的結(jié)核病患兒中，GeneXpert檢測各種標本總的敏感度和特異度分別為28.6%和87.5%；在肺外標本中，膿液穿刺液中的敏感度較高，接近100.0%，腦脊液和漿膜腔積液中檢出率極低。本研究GeneXpert法檢測胃液的敏感度介于上述結(jié)果之間，顯著高于腦脊液和漿膜腔積液的檢出率，高于Nicol等[19]報告的糞便檢出率(33.3%)，也高于GeneXpert法檢測痰液的敏感度(62%)[20]。可見，與傳統(tǒng)的檢測方法比較，GeneXpert法的診斷效能更高，且極大地縮短了檢測時間，有助于兒童結(jié)核病的早期診斷；胃液檢測具有良好的臨床應(yīng)用價值。

本研究患者為涂陽培陽時，GeneXpert檢測的陽性檢出率為96.7%，與張愛梅等[18]的研究結(jié)果(100%)一致，患者為涂陰培陽時GeneXpert檢測的陽性檢出率為81.8%，高于張愛梅等[18]的報道(33.3%)；GeneXpert在涂陽標本中的陽性檢出率為97.1%(34/35)，與文獻報道相近[21-22]；但在涂陰標本中陽性檢出率僅為57.5%(46/80)，低于Li等[22]的報道，考慮與部分低齡兒童很難取到高質(zhì)量、充足的胃液有關(guān)，多次、足量抽取胃液可能會提高檢出率。在以培養(yǎng)為標準時，Scott等[23]與Chisti等[24]的研究中，GeneXpert檢測的敏感度分別為59%和67%；本研究以MGIT 960法為標準，GeneXpert檢測的敏感度為88.9%，高于上述結(jié)果，與最新的一項Meta分析中報道的結(jié)果一致(87%)[22]。對于MGIT 960法檢測結(jié)果陰性的標本，GeneXpert法也有較高的檢出率(46.2%)。

國外有文獻報道，在將GeneXpert檢測利福平耐藥結(jié)果和表型藥敏試驗結(jié)果比較時，二者的一致性較高[25-26]。作為利福平耐藥的快速檢測，GeneXpert檢測結(jié)果一般非常好，檢測的敏感度、特異度分別為94%、98%[25]。本研究以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果作為參考標準，GeneXpert法檢測利福平耐藥的敏感度為100.0%(11/11)，特異度為 95.6%(43/45)，與MGIT 960藥敏試驗結(jié)果具有較好的一致性(Kappa值=0.894)，與上述文獻結(jié)果一致，也與國內(nèi)韓丹等[15]的報道相符。有2例MGIT 960藥敏試驗結(jié)果顯示敏感，而GeneXpert檢測結(jié)果為耐藥的患者，由于條件所限，沒有進行基因測序驗證。導(dǎo)致耐藥性檢測結(jié)果不一致的原因考慮有以下可能：(1)敏感菌和耐藥菌混合生長時，GeneXpert檢測更敏感，檢測結(jié)果為耐藥；(2)GeneXpert法對rpoB基因為啞基因時的菌株可能出現(xiàn)假陽性，而啞基因并不會改變其相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達，造成與表型藥敏試驗結(jié)果不一致。

GeneXpert檢測MTB敏感、快速,但也存在以下弊端：(1)由于其僅憑單一的靶基因擴增和檢測單一的rpoB基因耐藥決定區(qū)，可能導(dǎo)致產(chǎn)生一定的假陰性，本研究63例培陽標本中，有7例GeneXpert法檢測陰性；(2)GeneXpert法檢測野生型與突變型菌株混合標本的利福平耐藥相關(guān)突變的能力有限[27]，且檢測某些導(dǎo)致利福平耐藥的rpoB基因C533G位點突變的能力也下降[28]；(3)檢測患者混合感染時探針D和E產(chǎn)生的實時信號延遲，以及GeneXpert法會錯誤識別無法導(dǎo)致利福平耐藥的rpoB基因F514F位點沉默突變，而F514F位點本身為利福平耐藥的無功能突變[29]，導(dǎo)致GeneXpert檢測偶爾會產(chǎn)生少量樣本利福平耐藥的假陽性報告[30-31]；(4)不能檢測其他一線和二線抗結(jié)核藥物，最新的一篇Meta分析報道，GeneXpert法在檢測耐藥性方面，新發(fā)耐利福平的患者中有33.3%表現(xiàn)出對異煙肼敏感，而之前已接受抗結(jié)核藥物治療的耐利福平患者中有14.8%對異煙肼敏感[32]；可見在檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)上，GeneXpert法并不能準確反應(yīng)異煙肼耐藥情況，因此對于耐藥結(jié)核病發(fā)生率高的地區(qū)，不能作為MDR-TB調(diào)整治療的依據(jù)；(5)GeneXpert 法是基于核酸擴增，檢測結(jié)果陽性不一定存在活菌，也不能作為評判療效的指標[33]；(6)GeneXpert 檢測成本較高。

綜上所述，GeneXper法檢測過程簡單、快捷，敏感度高、特異度強，其利福平耐藥基因檢測與MGIT 960藥敏試驗結(jié)果具有較好的一致性，對兒童肺結(jié)核的早期診斷及指導(dǎo)治療具有良好的應(yīng)用價值；但GeneXpert也存在一些弊端，在臨床應(yīng)用過程中仍需結(jié)合其他實驗室方法進行綜合分析，以提高確診率和治愈率。