王燕飛 吳進鳳 孫倩 韓露 馬樹波 張治國

結核病仍然是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織[1]估算，2017年全球新發(fā)結核病患者1000萬例，因結核病死亡160萬例；我國是結核病高負擔國家之一，每年新發(fā)結核病患者88.9萬例，位居世界第二位。2010年全國結核病流行病學抽樣調查顯示，我國菌陽結核病的患病率約為66/10萬，比2000年降低約50%[2]。雖然結核病控制取得了顯著的成績，但是耐藥結核病的傳播成為我國結核病控制面臨的重大挑戰(zhàn)[3]。氟喹諾酮類藥物是最重要的二線抗結核藥物，因其具有強大的殺菌活性，因此在治療耐藥結核病，特別是在短程治療方案中發(fā)揮著重要作用[4]。對氟喹諾酮類藥物的耐藥性與二線抗結核藥物治療結核病的成敗密切相關[5]。本研究納入北京市昌平區(qū)2016—2018年全部分離的結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株，分析其對氧氟沙星的耐藥性及其分子流行病學特征。

材料和方法

一、菌株

本實驗所選取的701株結核分枝桿菌菌株為昌平區(qū)結核病防治所收集，取自于全區(qū)就診及管理的菌陽結核病患者。所有菌株經表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”；比例法)，以及采用對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)檢測進行菌種鑒定，其中耐多藥結核分枝桿菌51株，非耐多藥結核分枝桿菌650株。標準菌株H37Rv由國家結核病參比實驗室提供。

二、試劑來源

本研究使用的改良羅氏培養(yǎng)基及含藥羅氏培養(yǎng)基均購置于珠海貝索生物技術有限公司； 2×Taq預混液購自于北京康為世紀生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技術有限公司合成。

三、藥敏試驗

藥敏試驗采用WHO推薦的比例法進行[6]。培養(yǎng)基中藥物濃度分別為：利福平(RFP或R，40 μg/ml), 異煙肼(INH或H, 0.2 μg/ml),乙胺丁醇(EMB或E, 2 μg/ml), 鏈霉素(Sm或S, 4 μg/ml)，氧氟沙星(Ofx, 2 μg/ml)。每批藥敏試驗選取H37Rv菌株作為對照。

四、基因組DNA提取

采用簡單水煮法提取結核分枝桿菌基因組DNA[7]。從改良羅氏培養(yǎng)基斜面刮取一接種環(huán)結核分枝桿菌菌落，將菌落轉移至帶有1 ml 生理鹽水的無菌離心管中, 85 ℃ 30 min 滅活, 12 000×g離心5 min，棄上清；菌體沉淀用500 μl 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(TE緩沖液)(pH值為8.0)充分懸浮, 100 ℃金屬浴30 min, 冷卻至室溫后，12 000×g離心5 min，取上清即為粗提基因組DNA。

五、gyrA基因擴增和測序

合成先前文獻報道的引物對[7]，上游引物：5′-TCGACTATGCGATGAGCGTG-3′，下游引物：5′-GGTAGCACCGTCGGCTCTTG-3′，擴增氟喹諾酮耐藥相關基因gyrA基因片段415 bp。擴增體系包括：2×Taq預混液25 μl，上游引物 0.2 μmol，下游引物 0.2 μmol， 粗提基因組DNA 5 μl，并用去離子水補平到總體積50 μl?；驍U增條件如下：預變性94 ℃ 5 min; 7 min，循環(huán)94 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min， 72 ℃ 延伸10 min。基因擴增產物電泳檢測后送北京擎科生物技術有限公司測序。測序結果以標準敏感菌株H37Rv基因序列作為標準，采用BioEdit軟件進行比對。

六、定義

耐多藥結核分枝桿菌定義為至少同時對利福平和異煙肼耐藥的結核分枝桿菌菌株。初治患者定義為從未因結核病應用過抗結核藥物治療的患者，正進行標準化療方案規(guī)律用藥而未滿療程的患者(登記分類以治療開始時為準)，不規(guī)則化療未滿1個月的患者；復治患者定義為因結核病不合理或不規(guī)律用抗結核藥物治療≥1個月的患者，初治失敗和復發(fā)患者的定義參考文獻[8]。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、2016—2018年對氧氟沙星的耐藥情況及耐藥率比較

表1 MTB臨床分離株對氧氟沙星耐藥情況 [株(構成比，%)]

進一步分析顯示，MDR-MTB和非MDR-MTB對氧氟沙星的耐藥率分別為37.2%(19/51)和3.4%(22/650)，MDR-MTB耐藥率明顯高于非MDR-MTB(P<0.01)。此外，復治患者耐藥率為10.0%(3/30)，與初治患者5.7%(38/671)的耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

二、氧氟沙星耐藥菌株的gyrA突變特征

對全部41株比例法藥敏試驗確定對氧氟沙星耐藥菌株的gyrA基因序列進行分析，總計有31株(75.6%)檢測到gyrA基因突變。其中最常見的突變位點在94位密碼子(36.6%)，上述突變導致94位的天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?14.6%)、丙氨酸(9.7%)、天冬氨酸(7.3%)、酪氨酸(2.5%)或者組氨酸(2.5%)。除94位密碼子突變外，90位點氨基酸是第2種常見的突變類型，占全部耐藥菌株的34.1%，且突變類型均為丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。此外，還有2株(5.0%)對氧氟沙星耐藥菌株突變位點為91位絲氨酸突變?yōu)楦彼?。見?。

表2 不同類別患者MTB分離株對氧氟沙星的耐藥率比較 [株(構成比，%)]

表3 41株對氧氟沙星耐藥MTB的gyrA基因突變特征

注Ala：丙氨酸；Ser：絲氨酸；Asp：天冬氨酸；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：蘇氨酸；Asn：天門冬酰胺；Gly：甘氨酸

討 論

本研究基于北京市昌平區(qū)收集的MTB臨床分離株，開展了氧氟沙星耐藥率動態(tài)趨勢變化研究及耐藥菌株的分子流行病學研究；結果表明昌平區(qū)在過去的3年內所有培養(yǎng)陽性MTB菌株對氧氟沙星的耐藥率有顯著增加的趨勢。近期一項基于全國結核病流行病學調查收集的MTB菌株的研究表明，我國2010年對氟喹諾酮類藥物的耐藥率明顯高于2000年[9]，與本研究結果類似。

對氟喹諾酮類藥物耐藥率的增加主要歸因于兩方面因素：(1)我國存在抗生素的濫用現(xiàn)象，特別是氟喹諾酮類藥物，由于其廣譜的抗菌活性及低水平的不良反應率，被廣泛用于呼吸道感染的治療。部分結核病疑似患者在不規(guī)律使用氟喹諾酮類藥物后極易產生耐藥，因此導致了氟喹諾酮耐藥率的明顯上升[10]。(2)我國抗生素不僅廣泛用于治療各種感染性疾病，同時在畜牧業(yè)等領域大規(guī)模使用。據(jù)一項環(huán)境學監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，我國主要河流中，抗生素檢出濃度遠高于正常水平[11]，提示我國環(huán)境中抗生素超標，特別是大環(huán)內酯類、青霉素，以及氟喹諾酮類藥物，環(huán)境中抗生素的濃度上升對于結核病患者耐藥率的提升可能存在一定作用。因此，本研究提示對氟喹諾酮類藥物的強化管理和合理使用對于結核病、特別是耐藥結核病的防治具有重要意義。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)MDR-MTB中有超過1/3對氟喹諾酮類藥物耐藥。近期WHO[12]修訂了MDR-TB的治療指南，其中氟喹諾酮類藥物作為3種核心藥物之一要求加入MDR-TB治療方案中。鑒于氟喹諾酮在MDR-TB治療成敗中的核心作用，本地區(qū)對氟喹諾酮類藥物高耐藥率提示有必要在使用前開展藥敏試驗檢測，特別是分子藥敏檢測，以指導MDR-TB的治療，提高其治愈率，并減少其在人際間的傳播。

gyrA是對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要相關基因，且氟喹諾酮類藥物耐藥性突變主要發(fā)生在該基因的88、90、91、94位點。本研究結果表明，昌平區(qū)75.6%對氧氟沙星耐藥的MTB是由于gyrA基因突變引起，這與先前來自上海(76%)的研究結果一致[13]，但低于俄羅斯(83%)[14]、高于紐約(67%)[15]和突尼斯(50%)[10]；導致gyrA基因突變頻率地區(qū)差異的主要原因可能是各地區(qū)流行的MTB分子流行病學特點不同。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)約25%對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株未見gyrA基因突變；一方面，DNA拓撲異構酶B亞基(gyrB)基因也是氟喹諾酮類藥物的潛在靶標，先前研究表明約有2%～10%對氟喹諾酮類藥物耐藥的MTB與gyrB基因相關；另一方面，藥物外排泵和細胞壁通透性可能在氟喹諾酮類藥物耐藥性上發(fā)揮了一定作用。然而，上述兩種機制在本研究中均未涉及，后期當聚焦于部分未發(fā)生gyrA突變菌株對氧氟沙星耐藥的機制進行研究。