黎金鳳 虞莉 范恩勇

[摘要] 目的 了解揚(yáng)州市2015年2月～2017年12月無償獻(xiàn)血者抗-HIV抗體及HIV-RNA檢測(cè)情況。 方法 針對(duì)揚(yáng)州市2015年2月～2017年12月121 617例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本先進(jìn)行2遍ELISA法檢測(cè)抗-HIV抗體，然后對(duì)ELISA法結(jié)果兩側(cè)陰性或單側(cè)陰性的116 500例核酸標(biāo)本再用PCR法檢測(cè)HIV-RNA?？?HIV抗體陽(yáng)性送揚(yáng)州CDC確證，HIV-RNA陽(yáng)性送江蘇省血液中心進(jìn)一步確證。 結(jié)果 2015年2月～2017年12月抗-HIV抗體檢出陽(yáng)性57例，占0.05%，確證陽(yáng)性13例，占0.01%;確證陽(yáng)性均為ELISA法雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本，ELISA法單試劑陽(yáng)性經(jīng)確證均為陰性; HIV-RNA陽(yáng)性檢出 4例，占0.003%，確證陽(yáng)性2例，占0.002%。 結(jié)論 采、供血機(jī)構(gòu)相關(guān)部門在獻(xiàn)血前征詢招募時(shí)，應(yīng)充分考慮人群HIV 感染分布特征，調(diào)整策略，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)HIV相關(guān)知識(shí)的宣傳普及工作，進(jìn)一步確保血液安全。在血液病毒檢測(cè)中，核酸檢測(cè)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)各具優(yōu)勢(shì)，兩者互補(bǔ)，給予二者聯(lián)合應(yīng)用，提高血液病毒檢測(cè)準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞] 無償獻(xiàn)血者;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);核酸檢測(cè);人類免疫缺陷病毒

[中圖分類號(hào)] R193.3 ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）13-0123-04

[Abstract] Objective To understand the anti-HIV antibody and HIV-RNA detection of unpaid blood donors in Yangzhou City from February 2015 to December 2017. Methods Anti-HIV antibodies were detected by two-pass ELISA in 121， 617 unpaid blood donors from February 2015 to December 2017 in Yangzhou City. Then， the HIV-RNA of 116， 500 nucleic acid samples with both-sided negative or one-sided negative ELISA results were detected by PCR. The anti-HIV antibody positive samples were sent to Yangzhou CDC for confirmation， and the HIV-RNA positive samples were sent to the Jiangsu Provincial Blood Center for further confirmation. Results 57 cases of positive anti-HIV antibodies from February 2015 to December 2017 accounted for 0.05%. And 13 were positive， accounting for 0.01%. Confirmed positive specimens were ELISA double reagent positive specimens. Single reagent positive specimens by ELISA method were negative after confirmation. There were 4 cases of positive HIV-RNA， accounting for 0.003%， and 2 cases of confirmed positive， accounting for 0.002%. Conclusion Relevant departments of blood collection and blood supply institutions should fully consider the distribution characteristics of HIV infection in the population and adjust the strategy when consulting for recruitment before donating blood. Relevant departments should strengthen the promotion and popularization of HIV-related knowledge to further ensure blood safety. In the detection of blood virus， nucleic acid detection and enzyme-linked immunosorbent assay have their own advantages， and the two complement each other， and the two are combined to improve the accuracy of blood virus detection.

[Key words] Unpaid blood donors; Enzyme-linked immunosorbent assay; Nucleic acid detection; Human immunodeficiency virus

臨床輸血目前是挽救人類生命的、其他醫(yī)學(xué)技術(shù)不可替代的重要治療手段，同時(shí)臨床輸血也是傳播傳染性疾病的主要途徑之一，如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等輸血傳播性疾病，特別是艾滋相關(guān)的人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的傳播，更是引起采供機(jī)構(gòu)和臨床醫(yī)院重點(diǎn)關(guān)注的焦點(diǎn)。HIV病毒進(jìn)入人體后會(huì)破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人體免疫功能異常， 抵抗力下降，最終引發(fā)一系列疾病[1]。隨著臨床用血量逐年增加，無償獻(xiàn)血人數(shù)也相應(yīng)增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，經(jīng)血液傳播感染艾滋病的人數(shù)占全球HIV 感染者的5%～10%[2]。因此，向臨床提供安全、優(yōu)良的血液及血液制品是我們采、供血機(jī)構(gòu)共同追求的目標(biāo)[3]。近年來，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，特別是試劑方法的改進(jìn)和靈敏度的提高，血液質(zhì)量和輸血安全也得到了極大的改善。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有抗體診斷、抗原診斷和病毒載量試驗(yàn)[4]。為了解無償獻(xiàn)血者人群中HIV的感染情況，現(xiàn)將揚(yáng)州市中心血站2015年2月～2017年12月121 617例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本抗-HIV抗體和HIV-RNA的檢測(cè)情況進(jìn)行回顧性調(diào)查分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

121 617例標(biāo)本均來自揚(yáng)州市中心血站2015年2月～2017年12月年無償獻(xiàn)血者，年齡均18～55周歲，所有獻(xiàn)血者均符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 ?酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑由北京科衛(wèi)和廈門新創(chuàng)提供，核酸試劑由上?？迫A提供，試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 方法 ?抗-HIV抗體采用ELISA法進(jìn)行2遍檢測(cè)，2遍采用不同設(shè)備、不同廠家試劑、不同工作人員。ELISA法的實(shí)驗(yàn)原理：采用雙抗原夾心法兩步法原理檢測(cè)人血清中或血漿樣本中的抗-HIV抗體。在微孔板預(yù)包被基因重組HIV抗原。當(dāng)待檢樣本中存在抗-HIV抗體時(shí)，將反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，再與加入的酶標(biāo)記基因工程HIV抗原反應(yīng)，最后形成“固相HIV抗原-HIV抗體-酶標(biāo)記HIV抗原”的免疫復(fù)合物，加入底物后形成顯色反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）加入血清至試劑盒內(nèi)微孔板37℃孵育60 min;（2）洗板去除剩余血清;（3）加酶再37℃孵育30 min;（4）洗板去除剩余酶;（5）加底物顯色液37℃孵育30 min;（6）加終止液;（7）比色。最終比色由酶標(biāo)儀自動(dòng)完成。每批次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照，與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果以s/cutoff（每孔吸光度A/cutoff，cutoff根據(jù)試劑說明書設(shè)置）表示，結(jié)果s/cutoff≥0.7為陽(yáng)性，<0.7為陰性。兩側(cè)檢測(cè)為陽(yáng)性或其中一側(cè)檢測(cè)為陽(yáng)性最終結(jié)果均為陽(yáng)性，兩側(cè)檢測(cè)均為陰性最終結(jié)果為陰性。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按操作規(guī)程和試劑說明書進(jìn)行。

HIV-RNA的核酸檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase ?Chain ?Reaction，PCR），采取8人份標(biāo)本混合檢測(cè)模式（8×180 μL=1.44 mL），將標(biāo)本先進(jìn)行混樣，混樣結(jié)束后，先加裂解液將DNA從細(xì)胞內(nèi)裂解出來，再加磁珠吸附DNA，加洗滌液洗滌和洗脫液洗脫，最后提取DNA上清，移入擴(kuò)增板加入擴(kuò)增試劑，放入PCR全自動(dòng)擴(kuò)增儀擴(kuò)增，PCR工作原理：在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動(dòng)合成，通過一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5→3方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR由變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的高溫變性;②模板DNA與引物的低溫退火（復(fù)性）;③引物的適溫延伸。混檢結(jié)果陽(yáng)性次日再將8個(gè)標(biāo)本拆分單檢（1.44 mL），混檢結(jié)果陰性最終結(jié)果為陰性。單檢檢測(cè)模式同混檢，單檢陽(yáng)性者最終結(jié)果為陽(yáng)性，單檢陰性最終結(jié)果為陰性。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按操作規(guī)程和試劑說明書進(jìn)行。

檢測(cè)策略：2遍ELISA法抗體檢測(cè)+1遍核酸檢測(cè);先進(jìn)行2遍ELISA法檢測(cè)抗-HIV抗體，然后對(duì)ELISA法兩側(cè)陰性或單側(cè)陰性標(biāo)本再進(jìn)行PCR法檢測(cè)HIV-RNA。對(duì)ELISA法抗-HIV抗體陽(yáng)性者送揚(yáng)州市CDC進(jìn)一步確證。核酸檢測(cè)HIV-RNA陽(yáng)性者送江蘇省血液中心進(jìn)一步確證。

1.3 儀器與設(shè)備

STAR 8-CH全自動(dòng)加樣系統(tǒng)（瑞士HAMETLON公司），F(xiàn)AME 24/20全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)（瑞士HAME TLON公司），ABI7500全自動(dòng)擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），ESCOⅡ型生物安全柜（新加坡ESCO公司），漩渦混合儀，手掌型離心機(jī)等。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)2015年2月～2017年12月121 617例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本抗-HIV 抗體ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性率及送揚(yáng)州市CDC確證陽(yáng)性率，同時(shí)針對(duì)抗-HIV 抗體陽(yáng)性標(biāo)本不同試劑的檢測(cè)結(jié)果，分析其確證結(jié)果情況。觀測(cè)2015年2月～2017年12月116 500例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本的HIV-RNA核酸檢測(cè)情況及陽(yáng)性標(biāo)本送省血液中心確證后的結(jié)果。分析ELISA法檢測(cè)抗- HIV抗體陽(yáng)性者送揚(yáng)州CDC進(jìn)一步確證后，其陽(yáng)性者人群分布。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，2016年與2015年，2017年與2015年抗-HIV 抗體檢測(cè)陽(yáng)性率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法抗-HIV抗體檢測(cè)結(jié)果及WB確證結(jié)果

2015年2月～2017年12月121 617例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本抗-HIV 抗體ELISA法檢測(cè)出57例陽(yáng)性，送揚(yáng)州市CDC用WB法確證出13例陽(yáng)性，見表1。

2.2 抗-HIV抗體陽(yáng)性結(jié)果組合與確證結(jié)果

57例ELISA 法抗-HIV抗體陽(yáng)性送檢者中，單試劑陽(yáng)性40例，雙試劑陽(yáng)性17例，WB法確證結(jié)果，見表2。

2.3 抗-HIV抗體陽(yáng)性結(jié)果不同試劑的S/CO值濃度分布與確證結(jié)果情況

兩種ELISA試劑抗-HIV抗體陽(yáng)性結(jié)果S/CO值濃度分布與確證結(jié)果情況，見表3。

2.4 HIV-RNA核酸檢測(cè)情況及陽(yáng)性標(biāo)本確證結(jié)果

2015年2月～2017年12月116 500例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本的HIV-RNA核酸檢測(cè)情況及陽(yáng)性標(biāo)本送省血液中心確證后的結(jié)果分析見表4。

2.5 HIV-RNA確認(rèn)陽(yáng)性獻(xiàn)血員的跟蹤隨訪

兩例HIV-RNA確認(rèn)陽(yáng)性獻(xiàn)血員經(jīng)后續(xù)進(jìn)一步跟蹤隨訪均為HIV感染窗口期。

2.6抗- HIV抗體確證陽(yáng)性者人群分布情況

ELISA法檢測(cè)抗- HIV抗體陽(yáng)性者送揚(yáng)州CDC進(jìn)一步確證后，其陽(yáng)性者人群分布情況見表5。

3 討論

HIV感染的主要傳播途徑為母嬰傳播、血液傳播和性傳播。其中血液傳播和性傳播是兩大主要傳播途徑。包括不安全性行為、MSM、靜脈吸毒等，亦有經(jīng)輸血傳播HIV的病例[5，6]。由于HIV是RNA病毒，較DNA病毒易變異、不穩(wěn)定，且存在檢測(cè)窗口期，血液檢測(cè)陰性不能完全排除輸血后HIV感染的可能，因此，了解HIV在無償獻(xiàn)血者人群中的分布對(duì)于進(jìn)一步加強(qiáng)血液安全尤為重要。

從表1可以看出，本市2015～2017年ELISA共檢測(cè)121 617例標(biāo)本，抗-HIV初篩有反應(yīng)性為57例（0.05%），確認(rèn)陽(yáng)性13例（0.01%），與2015年相比較，2016年和2017年陽(yáng)性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低于廣西沿海地區(qū)0.04%的感染率[7]，低于北海市0.045%的感染率[8]，但高于徐州市0.005%的感染率[9]。

從表2、3可以看出，兩種ELISA試劑初篩一側(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本確認(rèn)結(jié)果均為陰性，兩種ELISA試劑初篩均陽(yáng)性確認(rèn)結(jié)果陽(yáng)性率為76.5%（13/17），兩種ELISA試劑初篩結(jié)果S/CO≤10，確認(rèn)結(jié)果均為陰性，S/CO>10的初篩標(biāo)本，北京科衛(wèi)的確認(rèn)陽(yáng)性率為81.3%（13/16），廈門新創(chuàng)的確認(rèn)陽(yáng)性率為81.3%（13/16）。隨著初篩S/CO值的升高，其確認(rèn)結(jié)果的陽(yáng)性率也逐漸升高，但S/CO比值較低并不能判定為抗-HIV陰性，要進(jìn)一步做后續(xù)追蹤隨訪和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)[10]。

從表4可以看出，本市2015～2017年核酸共檢測(cè)標(biāo)本116500例，HIV-RNA初篩陽(yáng)性4例（0.003%），確認(rèn)陽(yáng)性2例（0.002%）。兩例HIV-RNA確認(rèn)陽(yáng)性獻(xiàn)血員經(jīng)后續(xù)跟蹤隨訪為HIV窗口期感染。因此，核酸檢測(cè)可檢測(cè)出HIV弱陽(yáng)性標(biāo)本，提高HIV檢出率，有力增強(qiáng)了輸血安全性[11]。

從表5可以看出，確認(rèn)陽(yáng)性結(jié)果中：性別分布以男性為主占76.9%，年齡分布以18～45歲為主占84.6%，學(xué)歷分布以低學(xué)歷為主占76.9%，職業(yè)分布以以個(gè)體和公司職員為主占100%，婚姻狀況以已婚為主占76.9%。獻(xiàn)血情況以首次為主占61.5%。（1）HIV感染者主要是男性，占76.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性感染者。一方面可能是男性的社交活動(dòng)較多;另外，男男同性戀（MSM）是HIV高危人群，MSM人群HIV 感染率較高，是HIV流行的重要人群之一。（2）感染者中18～45歲人群較多占84.6%，這個(gè)年齡段的人群處于性活躍期，由于目前社會(huì)對(duì)性觀念的改變，不同程度受到性開放、婚前性行為、性亂行為的影響，外加社會(huì)上的一些惡劣風(fēng)氣諸如賣淫、嫖娼的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。45～55歲僅占15.4%。（3）低學(xué)歷占76.9%，這類感染人群的文化程度較低，防病治病意識(shí)比較淡泊，傳統(tǒng)的說教宣傳很可能難以引起這類人群的重視和理解、接受，未能收到較好效果，應(yīng)尋求和探索更適合這類人群的宣傳策略。研究生占15.4%，本科生占7.7%。（4）職業(yè)分布以個(gè)體和公司職員為主占100%，這類人群相對(duì)流動(dòng)性較大。（5）婚姻狀況以已婚為主占76.9%。已婚人群性傳播機(jī)會(huì)較多，這是HIV重要傳播途徑。（6）獻(xiàn)血情況以首次為主占61.5%。多次獻(xiàn)血人群相對(duì)安全些。（7）人群戶籍分布沒有明顯差異。從年齡、學(xué)歷分布等可以看出HIV感染者已從高危人群向低危人群擴(kuò)散。因此，采、供血機(jī)構(gòu)應(yīng)采取積極有效的措施，聯(lián)合各大媒體開展對(duì)HIV的預(yù)防及傳播途徑等相關(guān)知識(shí)的宣傳。從以上整個(gè)人群分布可以看出，我們采、供血機(jī)構(gòu)在獻(xiàn)血征詢招募時(shí)，應(yīng)充分考慮獻(xiàn)血人群HIV感染分布特征，調(diào)整招募方案，進(jìn)一步保證血液安全。

因此，采、供血機(jī)構(gòu)應(yīng)聯(lián)合相關(guān)部門共同做好無償獻(xiàn)血宣傳工作，讓獻(xiàn)血者能充分認(rèn)識(shí)到高危行為的危害性，引導(dǎo)高危人群在獻(xiàn)血前進(jìn)行自我了解，排查，放棄獻(xiàn)血，工作人員也應(yīng)加強(qiáng)獻(xiàn)血前的健康咨詢工作，最大限度的排查高危獻(xiàn)血者[12]。盡量將HIV感染者于獻(xiàn)血前隔離，從源頭上保障輸血安全[13]。排查之余，為保證血液檢測(cè)質(zhì)量，提高檢測(cè)試劑的特異性和靈敏度，應(yīng)進(jìn)一步縮短檢測(cè)“窗口期”，約90%的血液漏檢導(dǎo)致患者輸血后感染是由 “窗口期”引起，“窗口期”已成為導(dǎo)致血液檢測(cè)漏檢并威脅患者生命安全的重要原因。目前抗-HIV檢測(cè)試劑中，第3代試劑的“窗口期”平均約為22 d，第4 代試劑增加了P24 抗原檢測(cè)，理論上“窗口期”平均縮短4～5 d，核酸試劑“窗口期”為7.4～9.1 d[7]，因此，無償獻(xiàn)血者標(biāo)本的核酸檢測(cè)非常有必要性，大大縮短了窗口期，提高了血液檢測(cè)的安全性。以上我們重點(diǎn)闡述了試劑靈敏度的重要性，試劑的特異性也很重要，從表1可以看出，抗-HIV酶免有反應(yīng)性，確認(rèn)陰性為77.2%（44/57），為試劑的非特異性反應(yīng)。因此應(yīng)提高試劑的特異性，避免血源的浪費(fèi)。同時(shí)，對(duì)這部分屏弊的假陽(yáng)性獻(xiàn)血員應(yīng)根據(jù)相關(guān)流程歸隊(duì)召回，避免獻(xiàn)血員的流失及對(duì)其造成的心理負(fù)擔(dān)[14]。

綜上所述，在獻(xiàn)血者血液標(biāo)本篩查檢測(cè)時(shí)，應(yīng)選擇先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法和儀器設(shè)備，確保臨床采、供血的進(jìn)一步安全。在血液病毒檢測(cè)中，核酸檢測(cè)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)各具優(yōu)勢(shì)，兩者互補(bǔ)，給予二者聯(lián)合應(yīng)用，提高血液病毒檢測(cè)準(zhǔn)確性[15]。同時(shí)，工作人員應(yīng)加強(qiáng)自身的保護(hù)，防止職業(yè)暴露。各采、供血機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)聯(lián)網(wǎng)工作，防止HIV感染者到處惡意獻(xiàn)血，加強(qiáng)屏蔽工作，從而進(jìn)一步保障血液安全[16]。

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（收稿日期：2019-01-12）