黃衛(wèi)彤 覃衛(wèi)娟 李筱瑜

[摘要] 目的 探討孕前育齡婦女亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T、A1298C基因和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）A66G基因檢測在出生缺陷防控技術(shù)應(yīng)用中的價值。 方法 選擇2015年1月～2016年12月在我院做孕前檢查的1338例育齡婦女為研究對象，抽取靜脈血，提取全血中的DNA，使用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測MTHFR C677T、A1298C基因突變位點和MTRR ?A66G基因突變位點，分析基因頻率分布情況。 結(jié)果 1338例孕前育齡婦女的MTHFR C677T位點CC、CT、TT基因型頻率分布分別為58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位點AA、AC、CC基因型頻率分布分別為62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G位點AA、AG、GG基因型頻率分布分別為53.1%、39.8%、7.1%。MTHFR C677T位點基因型頻率分布與佛山、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較，有顯著差異（χ2=189.81、663.24、791.40、99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位點基因型頻率分布與佛山、珠海、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較有顯著差異（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位點基因型頻率分布與鄭州、長春研究結(jié)果比較有顯著差異（χ2=7.290、6.432，P<0.05），而與佛山、珠海、九江、江蘇研究結(jié)果比較無顯著差異（χ2=3.500、0.534、0.537/3.351，P>0.05）。 結(jié)論 南寧市孕前育齡婦女MTHFRC677T TT、A1298C CC、MTRRA66G GG基因型頻率分布大致一致，但與國內(nèi)其他地區(qū)比較MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點基因型頻率分布有地域性差異。因此，孕前育齡婦女補(bǔ)充葉酸或葉酸缺乏者同時檢測MTHFR C677T位點、A1298C位點及MTRR A66G位點突變，能全面發(fā)現(xiàn)與葉酸代謝能力障礙的相關(guān)遺傳風(fēng)險，可為指導(dǎo)孕前育齡婦女預(yù)防和干預(yù)嬰兒出生缺陷提供可靠依據(jù)，在出生缺陷防控技術(shù)應(yīng)用中有重要的價值。

[關(guān)鍵詞] 孕前婦女;亞甲基四氫葉酸還原酶;甲硫氨酸合成酶還原酶;基因突變;出生缺陷

[中圖分類號] R446.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）13-0111-04

[Abstract] Objective To investigate the value of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）C677T， A1298C gene and methionine synthase reductase（MTRR）A66G gene detection in the application of birth defects prevention and control technology in pre-pregnancy women of childbearing age. Methods 1338 women of childbearing age who underwent pre-pregnancy examinations in our hospital from January 2015 to December 2016 were selected as study objects. Their venous blood was extracted， and the DNA from whole blood was extracted. MTHFR C677T， A1298C gene mutation site and the MTRR A66G gene mutation site was detected by real-time PCR. And the gene frequency distributions were analyzed. Results The frequency distributions of CC， CT and TT genotypes of MTHFR C677T loci in 1338 pre-pregnancy women of childbearing age were 58.6%， 35.0% and 6.4%， respectively. The frequencies of AA， AC and CC genotypes of MTHFR gene A1298C were 62.5%， 30.0%， 7.5%. The frequency distributions of AA， AG， and GG genotypes of ARR sites in the MTRR gene were 53.1%， 39.8%， and 7.1%， respectively. The frequency distributions of MTHFR C677T locus genotype in Nanning were significantly different from those in Foshan， Zhengzhou， Changchun， Jiujiang and Jiangsu（χ2=189.81， 663.24， 791.40， 99.09， 712.34， P<0.05）. MTHFR A1298C locus genotype frequency distributions in Nanning were significantly different from those in Foshan， Zhuhai， Zhengzhou， Changchun， Jiujiang and Jiangsu（χ2=45.33， 20.21， 60.92， 103.24， 22.83， 84.56， P<0.05）. There was a significant difference in MTRR A66G locus genotype frequency distributions between Nanjing and Zhengzhou， Changchun（χ2=7.290， 6.432， P<0.05）， but there was no significant difference between Nanjing and Foshan， Zhuhai， Jiujiang and Jiangsu（χ2=3.500， 0.534， 0.537/3.351， P>0.05）. Conclusion The frequency distributions of MTHFRC677T TT， A1298C CC and MTRRA66G GG genotypes in pre-pregnancy women of childbearing age in Nanning are roughly the same， but there are regional differences in the frequency distributions of MTHFR C677T， A1298C and MTRR A66G loci in Nanning compared with other regions in China. Therefore， the detection of MTHFR C677T locus， A1298C locus and MTRR A66G locus mutation in pre-pregnancy women of childbearing age supplemented with folic acid or folate deficiency can fully discover the genetic risk associated with folate metabolism dysfunction， and can provide a reliable basis for guiding prevention and intervention of infant birth defects in pre-pregnancy women of childbearing age. It has important value in the application of birth defect prevention and control technology.

[Key words] Pre-pregnancy women;Methylenetetrahydrofolate reductase;Methionine synthase reductase;Gene mutation;Birth defect

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）是葉酸-甲硫氨酸-同型半胱氨酸代謝循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，其酶活性水平與人體內(nèi)葉酸濃度、血漿同型半胱氨酸濃度密切相關(guān)[1]，MTHFR與MTRR基因突變引起葉酸缺乏和同型半胱氨酸升高，高同型半胱氨酸會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血小板激活聚集，破壞機(jī)體的凝血和纖溶系統(tǒng)[2]，出現(xiàn)血栓形成的傾向而導(dǎo)致流產(chǎn)，而且同型半胱氨酸在器官形成早期對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性，因此與神經(jīng)管缺陷相關(guān)。有文獻(xiàn)報道MTHFR基因突變率在懷有唐氏綜合征患兒的母親明顯升高，特別是MTHFR A1298C的CC基因型[3]與MTHFR C677T的TT基因型[4]是出生缺陷的遺傳高風(fēng)險因素。MTRR基因突變是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥的主要病因，也是同型半胱氨酸、葉酸代謝異常的主要原因之一，MTRR A66G基因型女性攜帶者未服用葉酸增補(bǔ)劑和低葉酸飲食的情況下均會增加胎兒唇腭裂的風(fēng)險，若以上兩種情況同時存在，則風(fēng)險進(jìn)一步增高[5]。因此，目前MTRR、MTHFR基因突變被認(rèn)為是多種出生缺陷疾病的遺傳高風(fēng)險因素，可作為孕前育齡婦女葉酸代謝能力障礙篩查基因，但基因位點突變頻率分布有地域性差別[6]。本研究采用熒光PCR法檢測1338例南寧市孕前育齡婦女葉酸代謝關(guān)鍵酶MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突變，旨在了解南寧市孕前育齡婦女MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突變頻率分布情況，為指導(dǎo)孕前育齡婦女預(yù)防和干預(yù)嬰兒出生缺陷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取于2015年1月～2016年12月期間到南寧市婦幼保健院產(chǎn)科門診進(jìn)行孕前檢查的1338例育齡婦女，年齡22～32歲，平均（27.1±4.9）歲，經(jīng)知情同意后，抽取靜脈血，提取全血中的DNA，采用熒光定量PCR法進(jìn)行MTHFR C677T、A1298C基因突變及MTRR ?A66G基因突變檢測，結(jié)果與國內(nèi)其他地區(qū)研究結(jié)果比較，分析基因突變頻率分布和地域性差異情況。

1.2材料與儀器

儀器試劑：①全自動核酸提取儀型號為廈門致善Lab-Aid820，配套提取試劑;②美國伯樂CFX96型熒光定量PCR擴(kuò)增儀，試劑來源于深圳奧薩制藥有限公司。③引物：MTHFR 677T ：5'-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA-3'，MTHFR A1298C： 5'-AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T]CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA-3'，MTRR A66G： 5'-AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT[A/G]TGTGAGCAAGCTGTGG-TACATGGAT-3'。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法 ?采集受檢者靜脈全血，利用全自動核酸提取儀提取全血中的DNA，提取的DNA濃度達(dá)到 20 ng/μL，純度比值達(dá)1.8以上既可進(jìn)行擴(kuò)增，使用熒光定量PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行檢測。

1.3.2 熒光定量PCR技術(shù) ?分別檢測分析葉酸代謝相關(guān)MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G基因突變位點。每個反應(yīng)體系20 μL：10 μL PCR混合液，0.25 μL探針，5.75 μL雙蒸水，4 μL樣本提取的DNA。擴(kuò)增程序如下：50°C預(yù)變性2 min，95°C預(yù)變性2 min，1個循環(huán);95°C變性15 s，60°C延伸1 min，45個循環(huán)。擴(kuò)增完成后，通過軟件合成擴(kuò)增儀VIC和FAM兩個通道所形成的S型擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷基因突變類型。

1.4 基因型頻率分布分析

將南寧市孕前育齡婦女MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突變頻率分結(jié)果與國內(nèi)佛山[7]、珠海[8]、鄭州[9]、長春[10]、九江[7]、江蘇[11]研究報道MTHFR C677T、A1298C位點突變及MTRR A66G突變頻率分布比較，分析個體基因突變頻率分布和地域性差異情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用擬和優(yōu)度χ2檢驗檢測各個位點的基因型分布是否符合哈-溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），P>0.05表明各基因型的分布符合HWE平衡;采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哈-溫（HWE）平衡檢測結(jié)果

本研究中，經(jīng)過HWE平衡定律檢驗，MTHFRC677T和MTRRA66G位點實際值與預(yù)計值吻合（P>0.05），說明群體遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體，具有本區(qū)域群體代表性。見表1。

2.2 MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位點基因型頻率分布與其他地區(qū)結(jié)果的比較

1338例孕前育齡婦女的MTHFR C677T位點CC（野生型）、CT（雜合子）、TT（純合子）基因型頻率分布分別為58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位點AA（野生型）、AC（雜合子）、CC（純合子）基因型頻率分布分別為62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G位點AA（野生型）、AG（雜合子）、GG（純合子）基因型頻率分布分別為53.1%、39.8%、7.1%，顯示個體基因突變頻率分布結(jié)果大致一致。MTHFR C677T位點基因型頻率分布與佛山、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較，有顯著差異（χ2=189.81、663.24、791.40、 99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位點基因型頻率分布與佛山、珠海、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較有顯著差異（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位點基因型頻率分布與鄭州、長春研究結(jié)果比較有顯著差異（χ2=7.290、6.432， P<0.05），而與佛山、珠海、九江、江蘇研究結(jié)果比較無顯著差異（χ2=3.500、0.534、0.537、3.351，P>0.05），顯示MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位點基因型頻率分布有地域性差別。見表2、表3。

3 討論

3.1 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因突變（雜合子、純合子）與葉酸代謝障礙相關(guān)系分析

1338例孕前婦女的MTHFR基因C677T位點、A1298C位點及MTRR基因A66G位點突變頻率分布結(jié)果顯示，MTHFR C677T TT、A1298C CC和MTRR A66G GG個體基因突變頻率分布均無明顯差異，說明本市孕前育齡婦女的MTHFR C677T TT、A1298C CC和MTRR A66G GG基因突變頻率大致一致。MTHFR和MTRR是葉酸代謝循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶[12]，其酶活性水平與人體內(nèi)葉酸濃度密切相關(guān)，有文獻(xiàn)報道攜帶MTHFR 1298C（AC或CC）基因者的酶活性只有野生型（AA）的78%[5]，攜帶MTHFR C677T CT基因型的酶活性只有野生型（CC）的65%，而基因型TT個體酶活性僅有30%[13]，攜帶MTRR A66G GG基因者的酶活性只有正常的30%，攜帶MTRR A66G AG基因者的酶活性只有正常的65%[11]。依據(jù)文獻(xiàn)報道提示本市部分孕前育齡婦女體內(nèi)存在葉酸代謝障礙和葉酸不足的風(fēng)險，葉酸缺乏會導(dǎo)致胚胎發(fā)育期的DNA和蛋白甲基化不足導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形、流產(chǎn)[13-16]。因此孕前育齡婦女檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位點突變，可篩查出葉酸代謝能力障礙相關(guān)遺傳基因[6]，為定期檢測葉酸含量及合理補(bǔ)充葉酸提供依據(jù)，達(dá)到預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷等出生缺陷相關(guān)疾病的發(fā)生[17]。

3.2 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因突檢測的臨床意義

研究結(jié)果顯示南寧市育齡婦女MTHFR C677T位點基因型頻率分布與佛山、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較有顯著差異;MTHFR A1298C位點基因型頻率分布與佛山、珠海、鄭州、長春、九江、江蘇研究結(jié)果比較有顯著差異;MTRR A66G位點基因型頻率分布與鄭州、長春研究結(jié)果比較有顯著差異，而與佛山、珠海、九江、江蘇研究結(jié)果比較無顯著差異。說明MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型頻率分布有地域性差別，與國內(nèi)學(xué)者報道基本一致[7-11]。因此，孕前補(bǔ)充葉酸或葉酸缺乏者，同時檢測MTHFR C677T位點、A1298C位點及MTRR A66G位點突變，不但能全面發(fā)現(xiàn)與葉酸代謝能力障礙的相關(guān)遺傳疾病的風(fēng)險，還可為個體化用量補(bǔ)服葉酸及療效觀察提供更可靠依據(jù)[18]，達(dá)到預(yù)防出生缺陷的目的。

綜上所述，本研究通過對南寧市1338例孕前育齡婦女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突變檢測，能全面發(fā)現(xiàn)孕前育齡婦女葉酸代謝能力障礙的相關(guān)遺傳疾病風(fēng)險，可為指導(dǎo)孕前育齡婦女預(yù)防和干預(yù)嬰兒出生缺陷提供可靠依據(jù)，在出生缺陷防控技術(shù)應(yīng)用中有重要的價值。

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（收稿日期：2018-12-28）