張皓，崔杰，李俊良，李昕晏，王琮玉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010019；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，哈爾濱150000）

0 引言

甜菜（BetavulgarisL.）為藜科甜菜屬植物，是我國重要糖料作物，主要在東北、西北及華北地區(qū)大面積種植[1]，該作物具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)。了解甜菜的抗逆機(jī)理，對(duì)于解決西北及華北甜菜主產(chǎn)區(qū)干旱和半干旱面積大、鹽堿發(fā)生率高制約甜菜生產(chǎn)及提高農(nóng)民收入水平都具有重要的作用。目前，甜菜耐鹽性主要進(jìn)行利用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的技術(shù)篩選耐鹽基因研究，而對(duì)其耐鹽機(jī)制的研究還較少[2]。對(duì)二倍體栽培甜菜品系M14采用不同濃度NaCl脅迫處理，鑒定出其根、葉中的差異蛋白各為43個(gè)和75個(gè)，這些蛋白質(zhì)主要參與光合作用、能量代謝、蛋白質(zhì)折疊和降解以及逆境脅迫與防御等生理生化過程[3]。我們課題組前期也開展了甜菜耐鹽性相關(guān)研究，如：甜菜耐鹽品系篩選研究[4]、DDRT-PCR技術(shù)分析鹽脅迫下甜菜耐鹽相關(guān)基因差異表達(dá)研究[5]、利用雙向電泳技術(shù)初步篩選甜菜鹽脅迫相關(guān)蛋白研究[6]以及甜菜耐鹽相關(guān)microRNA篩選及其靶基因表達(dá)研究[7]等。不僅獲得了耐鹽品系，還找到了耐鹽相關(guān)基因片段及參與調(diào)控的代謝過程。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，以篩選的甜菜耐鹽品系“O”68為材料，克隆了調(diào)節(jié)脯氨酸代謝的關(guān)鍵酶基因P5CS，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步了解掌握鹽脅迫下P5CS基因表達(dá)情況，對(duì)了解逆境下脯氨酸積累的分子機(jī)理，提高作物的抗逆性意義重大。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

甜菜“O”68品系是經(jīng)過篩選的耐鹽材料[4]，甜菜雙6品系是鹽敏感材料，均為哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院甜菜課題組選育。

1.1.2 試劑盒及載體

RNA提取采用TAKARA的Mini BESTPlant RNA Extraction Kit試劑盒按說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄采用Takara公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time），按說明書操作。T-載體和膠回收試劑盒均為TAKARA公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)化選用商品化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜幼苗的培育和處理

溫室培育甜菜幼苗，控制室內(nèi)溫度、光照、通風(fēng)，定期更換營養(yǎng)液。待甜菜長出2對(duì)、3對(duì)真葉時(shí)選擇長勢(shì)一致的甜菜幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理。鹽脅迫過程：300 mmol/L NaCl溶液分別處理0 h、12 h、24 h、48 h和72 h。

1.2.2 抗逆相關(guān)P5CS基因的克隆

提取甜菜幼苗葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，“產(chǎn)物”回收后與T-載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、培養(yǎng)、鑒定陽性克隆，用于測(cè)序。

1.2.3 抗逆相關(guān)P5CS基因生物信息學(xué)分析

在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上對(duì)克隆的基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用TMHMM Server v.2.0在線預(yù)測(cè)氨基酸序列的跨膜區(qū)域。

1.2.4 鹽脅迫下甜菜幼苗中P5CS基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)兩個(gè)品系2對(duì)、3對(duì)真葉期不同時(shí)間鹽處理的甜菜幼苗葉片進(jìn)行P5CS基因的表達(dá)情況分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗逆相關(guān)P5CS基因的克隆

2.1.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

甜菜幼苗葉片總RNA的提取按著試劑盒方法進(jìn)行，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1。

從圖上可以看到，提取的總RNA條帶清晰，幾乎無降解，紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA提取純度，提取的RNA OD260/OD280在1.8～2.1之間，純度較高，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 總RNA提取結(jié)果Fig.1 Total RNA extraction results

圖2 P5CS基因克隆電泳圖譜Fig.2 P5CS gene cloning and electrophoresismap

2.1.2P5CS基因的克隆與測(cè)序

將上述提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用高保真Taq酶克隆P5CS基因，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2。在1、3、5和7號(hào)泳道上出現(xiàn)了大小約2 300 bp的條帶，與預(yù)期相符，初步斷定樣品克隆成功。

PCR產(chǎn)物經(jīng)加A尾反應(yīng)及膠回收后與T-載體進(jìn)行16℃過夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、抗性平板培養(yǎng)篩選，對(duì)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行重組子的鑒定，篩選結(jié)果獲得如圖2同樣大小的目標(biāo)條帶，可用于后續(xù)測(cè)序。

通過測(cè)序與序列分析結(jié)果表明，甜菜P5CS基因其全長為2 325 bp，編碼框?yàn)? 151 bp，共編碼716個(gè)氨基酸（見圖3）。

2.2 P5CS基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列比對(duì)

經(jīng)BLASTN進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)：克隆的P5CS核苷酸序列與多個(gè)物種中的P5CS基因序列有高度的同源性，與蒺藜（KC292266.1）、煙草（HM854026.1）、水稻（AY574031.1）、枸杞（KF771023.1）、石蒜（KT247899.1）、堿茅（HQ637435.1）、大豆（FM999730.1）、海濱錦葵（KR029088.1）、蕓豆（EU340347.1）的同源性分別為74.80%、74.31%、70.51%、73.75%、73.97%、69.26%、73.80%、72.25%，說明所克隆的片段為P5CS基因。分析還發(fā)現(xiàn)甜菜與C4植物玉米（DQ864376.1）、甘蔗（EF620362.1）以及?？浦参锷洌↘C202259.1）的同源性不是很高，分別為56.02%、32.00%、52.55%，構(gòu)建親緣關(guān)系樹見圖4。

圖3 P5CS基因序列Fig.3 P5CS gene sequence

圖4 甜菜P5CS基因與其他物種的核苷酸序列親緣關(guān)系樹Fig.4 Genetic relationship tree between sugar beet P5CS gene and other species

將克隆的P5CS基因氨基酸序列與上述物種BLASTP比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與蒺藜、煙草、水稻、枸杞、石蒜、堿茅、大豆、海濱錦葵、蕓豆的同源性分別為78.07%、77.25%、75.24%、77.19%、78.35%、73.02%、76.36%、78.21%、78.19%，甜菜與玉米、甘蔗、桑樹的同源性也不很高，分別為59.08%、35.06%、55.08%，見圖5。構(gòu)建親緣關(guān)系樹見圖6。

圖5 甜菜P5CS基因氨基酸序列與其他物種多序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Comparison of amino acid sequence of sugar beet P5CS gene with multiple sequences of other species

圖6 甜菜P5CS基因與其他物種的核苷酸序列親緣關(guān)系樹Fig.6 Sugar beet P5CS gene is related to the nucleotides sequence of other species

核苷酸及氨基酸序列比對(duì)結(jié)果均證實(shí)，已克隆的片段確定為甜菜的P5CS基因。序列提交到GENBANK，已通過審核，基因ID：KY019201。

2.2.2 氨基酸理化性質(zhì)分析

氨基酸理化性質(zhì)分析表明，分子量為77.4 kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.72，負(fù)電荷殘基數(shù)谷氨酸（Glu）+天冬氨酸（Asp）為96，正電荷殘基數(shù)賴氨酸（Lys）+精氨酸（Arg）為83，不穩(wěn)定系數(shù)為37.89（＜40），說明該蛋白比較穩(wěn)定；疏水系數(shù)為-0.095，說明該蛋白是親水蛋白。該蛋白序列中亮氨酸（Leu）含量最多，其次為丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、硒半胱氨酸（Sec）。P5CS蛋白的氨基酸組成及含量見圖7。

經(jīng)TMHMMServer v.2.0軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列的跨膜區(qū)域可知：該序列無跨膜區(qū)域，蛋白均在膜外，屬于膜外蛋白。

圖7 P5CS蛋白的氨基酸組成及含量Fig.7 Amino acid composition and content of P5CSprotein

2.2.3 結(jié)構(gòu)域分析

用軟件Inter Pro對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到8個(gè)結(jié)構(gòu)域，包含有Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶（P5CS）結(jié)構(gòu)域。此外還發(fā)現(xiàn)，該蛋白參與的生物過程包括脯氨酸生物合成過程（GO:0006561），代謝過程（GO:0008152）以及氧化還原過程（GO:0055114）。其作用是催化活性（GO:0003824）、谷氨酸-5-激酶活性（GO:0004349 activity）、谷氨酸-5-半醛脫氫酶活性（GO:0004350）以及氧化還原酶活性。

2.2.4 鹽脅迫下甜菜幼苗P5CS基因表達(dá)情況分析

本研究對(duì)2對(duì)、3對(duì)真葉期甜菜幼苗進(jìn)行了不同時(shí)間高鹽脅迫處理P5CS基因表達(dá)量變化分析，結(jié)果如圖8。從圖中可以看出不同品系、不同生長時(shí)期P5CS基因的表達(dá)量隨著脅迫處理時(shí)間的延長均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。說明隨著受鹽脅迫的程度逐漸加深，P5CS基因的表達(dá)量增加，進(jìn)而增加酶活性，促進(jìn)脯氨酸合成代謝，以此增強(qiáng)幼苗的抗脅迫能力。圖中還可以看出，耐鹽品系“O”68和鹽敏感品系雙6的P5CS基因的表達(dá)存在差異，耐鹽品系“O”68上調(diào)更加明顯。

圖8 鹽脅迫下甜菜幼苗葉片中P5CS基因相對(duì)表達(dá)量變化Fig.8 Changes of relative expression of P5CS gene in leaves of sugar beet seedlings under salt stress

3 結(jié)論

本研究成功克隆了P5CS基因（ID:KY019201），生物信息學(xué)分析ORF為2 151 bp，編碼由716個(gè)氨基酸組成的蛋白，該蛋白具有P5CS酶結(jié)構(gòu)域，是脯氨酸合成代謝關(guān)鍵酶。qRT-PCR分析表明：鹽脅迫下甜菜幼苗P5CS基因表達(dá)量隨著脅迫處理時(shí)間的延長呈上調(diào)趨勢(shì)，且幼苗受脅迫程度加深，而P5CS基因的表達(dá)上調(diào)明顯。

4 討論

與脯氨酸代謝相關(guān)的酶有多種，△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是由P5CS基因編碼的雙功能酶，是催化脯氨酸（Pro）生物合成的限速酶[7]。P5CS基因已從擬南芥、煙草、水稻、冰草等多種植物中分離出來，對(duì)其功能的多方面研究表明，P5CS基因在多種植物呈過表達(dá)或超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、高鹽及重金屬等非生物脅迫的抗逆性及耐受性明顯增強(qiáng)，由此證明，P5CS基因可顯著提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力。此外，在擬南芥中，已經(jīng)分離了兩個(gè)具有不同功能的P5CS基因，即P5CS1和P5CS2，其中P5CS1基因似乎在所有器官中普遍存在并表達(dá)，并且可通過應(yīng)激迅速誘導(dǎo)，而P5CS2只在經(jīng)歷分裂的細(xì)胞中表達(dá)[8]。作物中水稻P5CS1基因同樣也受鹽堿、干旱、低溫等非生物脅迫誘導(dǎo)，在各器官組織中普遍表達(dá)；P5CS2基因僅在成熟植物中表達(dá)，并可被氯化鈉和甘露醇誘導(dǎo)。

本研究克隆的甜菜P5CS基因與不同物種的P5CS基因在序列上存在一些差別，該基因的克隆對(duì)后續(xù)轉(zhuǎn)P5CS基因構(gòu)建突變體以及根據(jù)P5CS基因表達(dá)評(píng)估甜菜受脅迫程度都具有重要意義。