饒繼紅 何彪 涂長(zhǎng)春 張家寧 葛淑敏 龔文杰

摘要 為進(jìn)一步了解我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)健康斷奶仔豬攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的情況，對(duì)2017年采自我國(guó)25個(gè)省（市）38個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的斷奶仔豬咽拭子、肛拭子、血清共4 059份樣品進(jìn)行了高通量測(cè)序，然后對(duì)檢測(cè)到的病毒進(jìn)行RT-PCR或PCR驗(yàn)證。基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)結(jié)果顯示，健康斷奶仔豬的咽拭子、肛拭子、血清中共出現(xiàn)1 706條動(dòng)脈炎病毒科的病毒基因Reads，其中包括PRRSV。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增從咽拭子和肛拭子中共檢測(cè)出46個(gè)PRRSV樣品，樣品陽(yáng)性率為1.1%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為39.5%。同時(shí)，試驗(yàn)成功擴(kuò)增出7個(gè)毒株的ORF5基因，并進(jìn)行了序列測(cè)定?；贠RF5基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該試驗(yàn)獲得的PRRSV流行毒株為高致病性毒株，屬于Type Ⅱ中的Subgroup 4。對(duì)健康斷奶仔豬攜帶PRRSV的研究結(jié)果可為豬繁殖與呼吸綜合征的防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）;斷奶仔豬;ORF5;遺傳進(jìn)化分析

中圖分類號(hào) S852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.031

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract To further understand the prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） in healthy weaned piglets of pig farms in China， high throughput sequencing was carried on 4 059 samples from 38 largescale pig farms in 25 provinces （metropolitans） of China， including throat swabs， anal swabs and serum. Then the detected viruses was verified by RTPCR and PCR. Based on the metagenomics results of high throughput sequencing， it was found that 1 706 arteritis virus reads appeared in throat swabs， anal swabs and serum of healthy weaned piglets， including PRRSV. RTPCR results showed that 46 samples were PRRSV positive in throat swabs and anal swabs， the individual positive rate was 1.1% and the herd positive rate was 39.5%. In addition， ORF5 genes of 7 strains were amplified and sequenced. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of ORF5 genes showed that the sequenced PRRS viruses belonging to subgroup 4 of Type Ⅱ are closely related to highly pathogenic PRRSV. This study provided scientific basis for the prevention and control of PRRS in China.

Key words Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）;Weaned piglets;ORF5;Phylogenetic analysis

基金項(xiàng)目 “十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0500104）。

作者簡(jiǎn)介 饒繼紅（1993—），女，廣東韶關(guān)人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物病毒學(xué)。

通信作者：葛淑敏，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事生物檢測(cè)、單克隆抗體制備及特異性菌種篩選等研發(fā)工作;龔文杰，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物病毒學(xué)的預(yù)防控制研究。

收稿日期 2018-12-25

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染疾病，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）必須上報(bào)的動(dòng)物疫病之一[1-2]。PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales）動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）[3-5]，其基因組大小約為15 kb，由9個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框組成。PRRSV是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，包括8個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），其中ORF1編碼的蛋白與RNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2基因位于ORF1區(qū)，ORF5編碼重要的保護(hù)性抗原糖蛋白GP5。Nsp2和ORF5在PRRSV基因組中變異最大，是科學(xué)工作者研究PRRSV分子流行病學(xué)及其遺傳衍化規(guī)律常用的基因片段[6]。

PRRSV在美國(guó)已經(jīng)流行了30多年，在我國(guó)也流行了20余年，它仍然是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原體之一[7]。2006年，在我國(guó)高致病性PRRSV的暴發(fā)直接導(dǎo)致了200多萬(wàn)頭豬死亡[8]。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）具有高致病性和傳染性等特點(diǎn)，一旦傳播就會(huì)給我國(guó)乃至全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自2013年以來(lái)，由新的PRRSV變異株NADC30-like引起PRRV在我國(guó)的再次流行[9-10]。Guo等[11]系統(tǒng)分析了我國(guó)PRRSV的流行狀況，闡明了PRRSV-1和PRRSV-2在我國(guó)的流行情況。

斷奶仔豬處于一個(gè)較敏感的階段，斷奶效應(yīng)、中斷母體抗體供應(yīng)以及外在環(huán)境因素的改變都會(huì)影響斷奶仔豬的免疫機(jī)能，而仔豬的免疫系統(tǒng)一般4～8周才比較完善[12]。雖然我國(guó)大部分規(guī)?；i場(chǎng)都會(huì)對(duì)斷奶仔豬進(jìn)行PRRSV疫苗免疫，但健康斷奶仔豬是否存在PRRSV持續(xù)性感染現(xiàn)象仍是值得關(guān)注的問(wèn)題。為了進(jìn)一步了解我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)仔豬攜帶PRRSV的情況，筆者對(duì)2017年采集的國(guó)內(nèi)?；i場(chǎng)健康斷奶仔豬樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)和遺傳進(jìn)化分析，旨在為有效防控PRRSV提供數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品信息及處理。

2017年4—5月，從25個(gè)省（市）的38個(gè)近1年來(lái)無(wú)重大疫情的規(guī)?；i場(chǎng)采集1 353頭日齡40～45 d且無(wú)臨床癥狀的健康斷奶仔豬的咽拭子、肛拭子和血清，共4 059份，將其分裝于1 mL離心管中，加入高壓滅菌過(guò)的PBS（0.02 mol/L，pH 7.4），并將其置于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中冷凍儲(chǔ)藏，備用。

1.1.2 主要試劑與儀器。

BioFlux Simply 總RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京泰旭國(guó)際健康管理中心;2×Taq PCR Master Mix、Reverse Transcriptase M-MLV、 Random Primer，購(gòu)自天根生化科技有限公司;Prime STAR Max高保真酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker和Agarose等試劑購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 主要儀器。

無(wú)菌操作臺(tái)（The BAKER COMPANY）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）、制冰機(jī)（SANYO 公司）、PCR 儀（BioRad 公司）、電泳儀（BioRad 公司）、凝膠圖像處理系統(tǒng)（BioRad 公司）、-25 ℃冰箱（Haier公司）。

1.2 方法

1.2.1 高通量測(cè)序及病毒宏基因組學(xué)分析。

豬場(chǎng)樣本進(jìn)行混樣（5混1）后，參考He等[13]Sword of Viral Metagenomic（SVM）實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行離心取上清液、過(guò)濾、核酶消化、核酸提取、sscDNA合成、RNA降解、sscDNA純化、dscDNA合成、寡核酸降解、單引物擴(kuò)增、DNA檢驗(yàn)，并進(jìn)行SVM編號(hào)后，38個(gè)豬場(chǎng)共計(jì)38個(gè)SVM宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，并將基于高通量測(cè)序的病毒宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

1.2.2 樣品RNA提取。

將“1.1.1”中處理好的咽拭子、肛拭子、血清單樣樣品，分別取100 μL上清液用于RNA提取，具體試驗(yàn)操作步驟參考BioFlux Simply總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 10 μL、隨機(jī)引物（1 μmol）1.5 μL、Reverse Transcriptase M-MLV（200 U/μL）1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）1.5 μL，RRI反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（40 U/μL）0.5 μL，5×M-MLV buffer 4 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足20 μL。于42 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，95 ℃酶滅活5 min，獲得病毒基因組cDNA。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成。

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載各種基因型的PRRSV毒株序列，使用MEGA6.0軟件在NSP2基因保守區(qū)域兩端設(shè)計(jì)RT-PCR引物，上游引物PRRSV-FP為5′-CGGAAGAAACTGTCGGTG-3′，

下游引物PRRSV-RP為5′-CGCAGACAAATCCAGAGG-3′。ORF5基因擴(kuò)增的引物序列參照Kang等[14]的研究報(bào)道。ORF5基因擴(kuò)增的上游引物PRRSV-ORF5-FP為5′-AATGAGGTGGGCYACAACC-3′，下游引物PRRSV-ORF5-RP為5′-GCGTGACACCTTAAGGGC-3′。引物送交吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.2.5 RT-nPCR進(jìn)行樣品檢測(cè)。

由于樣品數(shù)量大，試驗(yàn)采用cDNA“5混1”的方法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，將檢測(cè)為陽(yáng)性的混樣，進(jìn)一步檢測(cè)單樣cDNA。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）如下：2×Taq Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物PRRSV-FP 1 μL，下游引物PRRSV-RP 1 μL，cDNA模板2 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);最后，72 ℃延伸10 min。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，并將陽(yáng)性產(chǎn)物送交吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.6 PRRSV ORF5 基因擴(kuò)增及測(cè)序。

選取陽(yáng)性樣品cDNA，用高保真酶對(duì)ORF5基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件同“1.2.5”，延伸時(shí)間改為 90 s。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增為陽(yáng)性的產(chǎn)物送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行純化及測(cè)序。

1.2.7 PRRSV ORF5 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及同源性分析。

利用MEGA 6.0軟件分析獲得的7條PRRSV ORF5基因序列，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。此外，利用DNAStar MegAlign與GenBank上收錄的PRRSV參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組學(xué)結(jié)果

將采集來(lái)自我國(guó)25個(gè)?。ㄊ校?8個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的咽拭子、肛拭子和血清進(jìn)行高通量測(cè)序后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康斷奶仔豬攜帶有動(dòng)脈炎病毒科等病毒，其中38個(gè)SVM宏基因組中有16個(gè)SVM宏基因組表出現(xiàn)動(dòng)脈炎病毒科病毒病毒基因片段，共1 706條Reads（表1）。

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