耿玉慧，沙雋伊，王文靜，賀祥珂，邴欣，*，余小影，賈敏，4，*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東濟(jì)南250012；3.乳山市檢驗檢測中心，山東威海264500；4.山東師范大學(xué)食品營養(yǎng)與安全校級重點實驗室，山東濟(jì)南250014）

環(huán)境雌激素具有高毒性難降解等特點，已成為威脅人類健康的重要因素之一，其常常被分為生物類雌激素、人工合成類雌激素、天然雌激素以及化學(xué)污染物等不同來源的環(huán)境雌激素。但環(huán)境雌激素檢測較為困難，主要是由于其種類繁多且每種存在許多結(jié)構(gòu)類似物。適配體具有特異性高、靈敏度好、易于修飾等優(yōu)點，可極大的降低結(jié)構(gòu)類似物之間的交叉反應(yīng)，適用于環(huán)境雌激素檢測。目前，利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）已篩選出多種環(huán)境雌激素適配體，并利用這些適配體開發(fā)出多種快速檢測的新方法，它可為環(huán)境雌激素的快速檢測提供理論依據(jù)，具有良好的發(fā)展前景，有助于人們更好的進(jìn)行檢測。

1 環(huán)境雌激素

環(huán)境雌激素對內(nèi)源性雌激素有明顯的干擾效應(yīng)，具體表現(xiàn)為它會干擾心血管、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)的正常功能，并可導(dǎo)致癌癥、肥胖以及雄性精子數(shù)量減少等疾病[1-2]。由于環(huán)境雌激素對整個生態(tài)系統(tǒng)具有一定的危害效應(yīng)，同時這種效應(yīng)具有極大的廣泛性和持久性，因此，環(huán)境雌激素的研究與檢測已成為各國學(xué)者的研究熱點。環(huán)境雌激素主要類型[3]見表1。

表1 環(huán)境雌激素種類及作用Table 1 The type and function of environmental estrogen

目前，化學(xué)分析方法和生物試驗分析方法是化合物的雌激素活性檢測的主要方法。其中化學(xué)分析方法中主要包括液相色譜分析法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜分析法、放射免疫法等[11]。生物分析方法分為體內(nèi)和體外試驗兩種[12]，如子宮生長實驗、重組基因酵母篩檢法等。然而，這些方法均存在一定的不足，化學(xué)分析方法花費(fèi)高，操作復(fù)雜，樣品易受到不同程度的干擾；生物實驗分析法耗時長，不適合大量的化合物的檢測且容易在篩選時產(chǎn)生誤差[13]。因此，開發(fā)具有高靈敏度，且可進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測環(huán)境雌激素的檢測技術(shù)顯得尤為重要。

2 核酸適配體

2.1 適配體技術(shù)

核酸適配體（aptamer）是指通過SELEX 技術(shù)在寡核苷酸文庫經(jīng)數(shù)輪篩選得到的單鏈DNA 或RNA 片段[14]，適配體可通過折疊成莖環(huán)、發(fā)卡、凸環(huán)、假結(jié)或G-四鏈體等二維或三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異結(jié)合[15]。相較于一般的抗體和酶，適配體具有高選擇性、高親和力、高穩(wěn)定性等優(yōu)點[16]。適配體技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)等方面[17]，為食品中存在的生物毒素[18]、金屬離子[19]及農(nóng)獸藥殘留[20]等污染因子的檢測提供了新的方法。

2.2 環(huán)境雌激素適配體篩選進(jìn)展

目前已篩選出適配體的環(huán)境雌激素有E2、炔雌醇（ethinylestradiol，EE）、孕酮（progesterone，P4）[21]和 BPA[22]。由于E2 是雌激素受體的最適靶標(biāo)，對E2 適配體的篩選、檢測方法及應(yīng)用也最多；EE、P4 的研究相對較少，對其適配體篩選也相對較少；BPA 作為重要的化工原料廣泛存在于環(huán)境中，其與人類生活密切相關(guān)，因此對BPA 適配體的研究和應(yīng)用也較多。

2.2.1 E2、EE 適配體篩選

2007年，Kim 等[23]首次利用 SELEX 技術(shù)在 7.2×1014mol 單鏈DNA 分子文庫中篩選出長度為76 mer的E2 核酸適配體，E2 的二級結(jié)構(gòu)模擬圖如圖1。

圖1 76 mer E2 適配體二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Secondary structure of 76 mer E2 aptamer

適配體與 E2 間的解離常數(shù)（Kd值）為 0.13 μmol/L，并利用最小自由能量算法對該適配體的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。該團(tuán)隊篩選的E2 適配體被廣泛應(yīng)用于E2的檢測領(lǐng)域。

2014年，Alsager 等[24]利用相同的方法篩選出長度為75 mer 的E2 適配體，二級結(jié)構(gòu)模擬圖如圖2，Kd值為25 nmol/L。為了提高所篩選適配體的親和力和特異性，2015年，Alsager 等[25]利用圓二色譜法檢測到該適配體上的3 個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，通過切除75 mer 適配體序列兩側(cè)多余的核苷酸得到22 mer 和35 mer 適配體，其Kd值分別為14 nmol/L 和11 nmol/L。通過計時庫侖分析法等分析發(fā)現(xiàn)，與75 mer 適配體相比，去除超多側(cè)翼核苷酸序列的兩段短適配體的特異性和選擇性大大提高。當(dāng)將剪切后的適配體應(yīng)用于納米金比色法檢測E2 時，方法靈敏度可提高約25 倍。

圖2 75 mer E2 適配體二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Secondary structure of 75 mer E2 aptamer

圖3 85 mer E2 適配體二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Secondary structure of 85 mer E2 aptamer

為提高適配體的特異性，Vanschoenbeek 等[26]針對E2 上不同功能團(tuán)，建立了A、B 兩個篩選程序，篩選針對不同功能團(tuán)的適配體，其二級結(jié)構(gòu)圖如圖3 所示。分別在兩個含1015寡核苷酸庫中得到了19 條和24 條E2 適配體，Kd值分別在 27 μmol/L～124 μmol/L 和0.9 μmol/L～6.0 μmol/L 之間。所得到的適配體對 E2 的特異性有所提高，但某些適配體對EE 仍存在較強(qiáng)的親和作用。為獲得E2 的高特異性和親和性適配體，Akki 等[27]隨后篩選出兩條 85 mer，86 mer 的 E2 適配體和一條EE 適配體，并利用平衡過濾法（equilibrium filter method，EFM）測得適配體的Kd值分別為0.6、0.65 μmol/L 和 0.95 μmol/L。并且測得 E2 適配體對 E2的選擇性是EE 的74 倍，EE 適配體對EE 的選擇性是E2 的53 倍。本試驗結(jié)果表明所篩選的適配體具有較高的特異性。

2.2.2 BPA、P4 適配體篩選

2011年，Minjoung 等[22]通過 SELEX 技術(shù)在包含1015mol 的寡核苷酸隨機(jī)文庫中，經(jīng)12 輪循環(huán)篩選得到長度為57 mer 的BPA 適配體，二級結(jié)構(gòu)如圖4 所示，并且利用Mfold 軟件通過最小自由能測定，對適配體#3 和#12-5 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用溶膠-凝膠芯片進(jìn)行適配體-BPA 夾心試驗，發(fā)現(xiàn)#3 能夠與BPA形成較好的夾心結(jié)構(gòu)，而#12-5 與BPA 的特異性相互作用相對較弱。適配體#3 的Kd值為8.3 nmol/L，該適配體隨后被廣泛應(yīng)用于BPA 檢測領(lǐng)域。

圖4 BPA 適配體二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Secondary structure of BPA aptamer

Jiménez 等[28]在一個 1.8×1015mol 單鏈 DNA 分子隨機(jī)文庫中經(jīng)過數(shù)輪篩選得到第一條P4 適配體，并通過熒光分析法和電化學(xué)阻抗譜測定出其Kd值為17 nmol/L，該P(yáng)4 的適配體與P4 類似物如E2 和炔諾酮（norethindrone，NET）未發(fā)生交叉反應(yīng)，因此 P4 適配體對P4 具有極高的特異性。

不同環(huán)境雌激素的結(jié)構(gòu)式千變?nèi)f化，因此其與適配體的作用位點不相同，這就導(dǎo)致通過SELEX 技術(shù)篩選得的適配體也不盡相同；同種靶標(biāo)通過改變篩選條件可得到不同的適配體，其長度、序列及二級結(jié)構(gòu)也不盡相同，因此適配體與靶標(biāo)的親和力、特異性也不盡相同，這為環(huán)境雌激素提供了更多的檢測方法。不同環(huán)境雌激素的結(jié)構(gòu)式及目前篩選得出的適配體長度、序列等信息見表2。

表2 已篩選的環(huán)境雌激素適配體Table 2 The screened environment estrogen adapter

3 基于適配體的環(huán)境雌激素檢測方法

核酸適配體作為一種新型識別分子，具有較高的選擇性、靈敏度，同時它易被修飾，可被廣泛應(yīng)用于分析檢測領(lǐng)域。由于其具有較高的特異性，適用于具有較多結(jié)構(gòu)類似物的環(huán)境雌激素的檢測。其易于合成和修飾的特點，為適配體的廣泛應(yīng)用提供較多的便利，比較常見的基于適配體的檢測方法主要包括比色法、熒光法和電化學(xué)法。

3.1 納米金比色法

納米金粒子具有表面等離子共振特性，其大小、形狀和分離距離發(fā)生變化時，會導(dǎo)致納米金粒子發(fā)生顯著的顏色變化[29]。而適配體可以通過靜電作用吸附于納米金表面，使納米金粒子在高鹽濃度下呈游離狀態(tài)，溶液為紅色；利用這一特性，在加入靶標(biāo)后，適配體與靶標(biāo)可以更好的進(jìn)行特異性結(jié)合，從而與納米金粒子解離，使金納米粒子失去適配體保護(hù)而凝聚變藍(lán)。利用該原理，建立了一種針對E2 的基于適配體納米金比色的檢測方法。

3.1.1 納米金比色法檢測E2

Liu 等[30]將長度為76 mer 的E2 適配體分解為P1（33 mer）、P2（43 mer）兩個片段，二級結(jié)構(gòu)見圖5 所示。

圖5 基于適配體的E2 比色檢測原理圖Fig.5 Scheme of colorimetric detection method of E2 based on aptamer

希望通過分解以提高比色法的靈敏度。試驗表明，分離后，P1+P2 仍保留最初76 mer 適配體的親和力和特異性，而最低檢出限（limit of detection，LOD）則降低到原來的10 倍，為0.1 ng/mL，線性范圍為0.1 ng/mL～105 ng/mL。靈敏度的增加可能是由較短序列的適配體與E2 的親和力升高，與納米金的親和力降低引起的。

Alsager 等[25]將75 mer 適配體剪切得到兩條22 mer和35 mer 短鏈適配體，建立了基于適配體的E2 比色法，其原理見圖6。

圖6 基于剪短適配體的E2 比色檢測原理圖Fig.6 Scheme of colorimetric detection method of E2 based on truncate aptamer

該團(tuán)隊分別比較了長度為75、35 mer 及22 mer 的適配體對E2 檢測的效果，發(fā)現(xiàn)75 mer 適配體的LOD為 5 nmol/L，線性范圍為 5 nmol/L～400 nmol/L；35 mer、22 mer 適配體均可將LOD 降低到800 pmol/L，但是35 mer 適配體的線性范圍為200 nmol/L～800 pmol/L；而22 mer 適配體的線性范圍僅為35 mer 適配體的一半。還發(fā)現(xiàn)，相比于22 mer 適配體，35 mer 適配體由于保留小部分冗余核苷酸，與納米金結(jié)合后仍能較好從其表面脫離下來與E2 結(jié)合。因此，保留部分冗余核苷酸片段，更有利于提高檢測的靈敏度。

3.1.2 納米金比色法檢測BPA、P4

納米金粒子的表面等離子共振特性同樣被應(yīng)用于BPA 和P4 的檢測中。Zhang 等[31]設(shè)計了納米金比色法快速檢測BPA 方法，該方法LOD 為1.5 nmol/L，線性范圍為1.5 nmol/L～500 nmol/L，在自來水和河水樣中的加標(biāo)回收率分別為100.9 %～112.7 %。Du 等[32]設(shè)計了基于適配體納米金比色對P4 快速檢測方法。該方法的LOD 為2.6 nmol/L，線性范圍為2.6 nmol/L～800 nmol/L，同時以水和尿液做加標(biāo)回收試驗，回收率可達(dá)84.4%～118.8%。

3.2 熒光分析法

熒光染料主要包括熒光素和量子點，具有強(qiáng)度高，易于標(biāo)記，發(fā)射波長范圍廣等特點。將熒光染料及其猝滅基團(tuán)等修飾到適配體上，根據(jù)適配體與靶標(biāo)的結(jié)合與解離所帶來的熒光信號變化，實現(xiàn)對靶標(biāo)的分析。適配體熒光分析法具有操作簡單，易于實現(xiàn)自動化，靈敏度高等優(yōu)點。

3.2.1 熒光分析法檢測E2

Huang 等[33]使用釕（Ru）復(fù)合物與量子點（QDs）作為熒光探針，實現(xiàn)了對E2 的快速檢測，其原理見圖7。

圖7 免標(biāo)記E2 熒光適配體傳感器原理圖Fig.7 Scheme of label-free fluorescent aptasensor for E2 detection

Ru 復(fù)合物可以猝滅QDs 的熒光，當(dāng)體系中存在E2 適配體時，Ru 復(fù)合物優(yōu)先與適配體結(jié)合，無法與QDs 結(jié)合，從而使熒光恢復(fù)；當(dāng)加入靶標(biāo)后，適配體與E2 結(jié)合從而與Ru 復(fù)合物分離，Ru 復(fù)合物與QDs 結(jié)合后將其熒光猝滅。因此，可根據(jù)熒光強(qiáng)度定性、定量分析E2。該方法的LOD 為37 nmol/L，線性范圍為0.08 μmol/L～0.4 μmol/L。

而Ni 等[34]建立了利用納米金粒子作為熒光猝滅劑，羅丹明（RhoB）做熒光指示劑的E2 熒光檢測方法，原理見圖8，該方法成功提高了檢測的靈敏度。當(dāng)體系中不存在E2 時，適配體將通過吸附于納米金表面，可使納米金粒子均勻分散于NaCl 溶液中，從而降低RhoB 的熒光強(qiáng)度；當(dāng)加入E2 時，適配體與E2 結(jié)合，與納米金分離，納米金粒子發(fā)生聚沉，其對RhoB 熒光強(qiáng)度的抑制作用減弱。因此可通過RhoB 的熒光強(qiáng)度變化檢測樣品中E2 的含量。該方法的LOD 為0.48 nmol/L，線性范圍為 0.48 nmol/L～200 nmol/L，在實際水樣中的回收率為94.3%～111.7%。

圖8 E2 熒光適配體傳感器原理圖Fig.8 Scheme of fluorescent aptasensor for E2 detection

3.2.2 熒光分析法檢測BPA

Zhu 等[35]利用熒光信號可以被氧化石墨烯（GO）猝滅的原理，設(shè)計了一步檢測BPA 的熒光方法。首先，將FAM 熒光標(biāo)記的適配體與不同濃度的BPA 標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)合，保證體系內(nèi)熒光強(qiáng)度相同；當(dāng)加入GO 后，GO 可以與未結(jié)合的適配體結(jié)合，并猝滅其熒光，熒光強(qiáng)度與BPA 含量成正比。該方法的LOD 為0.05 ng/mL，線性范圍為0.1 ng/mL～10 ng/mL，以水做加標(biāo)回收試驗，回收率為96.0%～104.5%。而Li 等[36]則建立了另一種方法BPA 的熒光檢測方法：他們以納米金顆粒作量子點熒光猝滅劑，該方法依據(jù)適配體與BPA 結(jié)合時會改變納米金顆粒的凝聚狀態(tài)，從而改變量子點的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)而計算出樣品中BPA 的含量。該方法的LOD 為1.86 ng/mL，線性范圍為10 ng/mL～80 ng/mL，以自來水為實際樣品做加標(biāo)回收實驗也得到了滿意的回收率。

3.3 電化學(xué)分析法

電化學(xué)法是指先將適配體固定于電極上，當(dāng)適配體與待測物結(jié)合后，改變電極上的化學(xué)反應(yīng)，從而改變電極的電化學(xué)信號。因此，可通過測定電極的電位、電勢、電流等的變化檢測待測物的濃度。

3.3.1 電化學(xué)法檢測E2

Kim 等[23]建立了基于適配體的電化學(xué)傳感器檢測方法來檢測E2，方法原理為將適配體固定于被修飾的金電極上，E2 與適配體的結(jié)合導(dǎo)致電極化學(xué)反應(yīng)發(fā)生改變，從而引起電流大小的改變，通過檢測電流來測定樣品中E2 的含量，該檢測方法的線性范圍為0.01 nmol/L～1.00 nmol/L。為提高檢測的靈敏度與特異性，Huang 等[37]利用硫化銅納米片和金納米粒子修飾玻碳電極及酶信號放大技術(shù)，通過伏安法檢測電壓的變化實現(xiàn)了對E2 特異性檢測。該方法的LOD為0.06 pmol/L，檢測范圍為 0.5 nmol/L～5.0 nmol/L。在實際樣品尿液中的加標(biāo)回收率為96.%～104.3%。基于相同的原理，Zhu 等[38]通過使用長度為75 mer E2適配體設(shè)計了E2 的高靈敏檢測方法，該方法LOD 為1 fmol/L，線性范圍可達(dá) 10 ng/mL～60 ng/mL，在自來水中也得到了良好的回收率。為進(jìn)一步提高分析性能，Povedano 等[39]于2017年將GO 納米復(fù)合材料修飾玻碳電極，戊二醛與漆酶在此納米復(fù)合物上進(jìn)行交聯(lián)從而改變電極的電化學(xué)信號，基于此原理建立了一種對E2 的快速檢測的方法。該方法的LOD 為0.54 pmol/L，線性范圍為0.9 pmol/L～11 pmol/L，在動物或合成尿液中的回收率分別為98.8%～100.4%和98.3%～99.5%。

3.3.2 電化學(xué)法檢測BPA

Liu 等[40]設(shè)計了基于雙信號放大的電化學(xué)法快速檢測BPA。首先，將納米金固定于玻碳電極上，適配體與納米金結(jié)合從而固定于電極上，然后與生物素修飾的互補(bǔ)DNA 探針雜交，形成雙鏈DNA。當(dāng)體系中含有BPA 時，由于適配體與BPA 特異性結(jié)合，與互補(bǔ)鏈分離，使BPA 被固定在傳感界面上，從而改變電化學(xué)信號。該方法的LOD 為0.41 pmol/L，線性范圍為0.001 nmol/L～1.000 nmol/L，且此方法對 BPA 的選擇性良好。Zhang 等[41]于2017年設(shè)計了基于金納米調(diào)節(jié)電路原理設(shè)計了快速檢測BPA 的方法。該方法的LOD為 1.5 ng/mL，線性范圍為4.4 ng/mL～66 ng/mL，以水為標(biāo)準(zhǔn)樣品做加標(biāo)回收試驗回收率為95.4%～106.8%。

3.3.3 電化學(xué)法檢測P4

Jiménez 等[28]利用其所篩選的 P4 適配體，設(shè)計了基于適配體的電化學(xué)傳感器檢測P4 的方法，該方法的 LOD 為 0.9 ng/mL，線性范圍為 10 ng/mL～60 ng/mL，以自來水為標(biāo)準(zhǔn)樣品的加標(biāo)試驗有較好的回收率。

科學(xué)研究是一個不斷發(fā)展、進(jìn)步的過程，通過不斷改進(jìn)環(huán)境雌激素檢測的方法和條件，從而不斷提高方法的靈敏度和檢出限。核酸適配體作為一種具有高靈敏度和特異性的分子識別探針，將受到越來越多科研工作者的青睞。目前，環(huán)境雌激素種類很多，但基于適配體技術(shù)對 E2 和 BPA 的檢測、報道最多，EE、P4 的檢測方法相對較少，還有大量未篩選出的適配體的環(huán)境雌激素仍需要人們進(jìn)一步的努力。已篩選得到適配體的環(huán)境雌激素的檢測方法、檢出限、線性范圍等信息見表3。

表3 部分環(huán)境雌激素檢測方法與結(jié)果Table 3 Some environmental estrogen detection methods and results

4 總結(jié)與展望

環(huán)境雌激素對于人體甚至環(huán)境的惡劣影響，它的研究與檢測已成為各國學(xué)者的研究熱點，而環(huán)境雌激素通常以極低的濃度出現(xiàn)，需要建立高靈敏度的分析方法。由于適配體與靶標(biāo)物質(zhì)有較好的結(jié)合力，較高的特異性，抗干擾性強(qiáng)，逐漸出現(xiàn)在人們的視野中，并已經(jīng)成功建立了如比色法、熒光分析法以及電化學(xué)法等等，這些方法較傳統(tǒng)的高效液相色譜法，氣相色譜法等等有操作簡單，經(jīng)濟(jì)實惠，用時較短等優(yōu)點。雖然利用適配體進(jìn)行環(huán)境雌激素的檢測還有一定的局限性，暫時還不能完全代替常規(guī)的儀器檢測方法，但是因為它可以現(xiàn)場快速檢測出結(jié)果，所以有廣闊的應(yīng)用前景一定的發(fā)展空間。