陳淑瓊，李曉月，吳晨爍，嚴(yán)芬

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

褐藻膠是β-D 甘露糖醛酸和其C-5 差向異構(gòu)體α-L 甘露糖醛酸通過1，4-糖苷鍵連接而成的[1]。主要從海帶、馬尾藻等褐藻植物的細(xì)胞壁中提取的一種酸性直鏈多糖，但因其凝膠性強、黏度大、水溶性較低，導(dǎo)致應(yīng)用有一定的局限性[2]。

褐藻寡糖是褐藻膠的寡聚物，是一種具有較強的溶解性、易吸收、安全無毒的化合物，研究表明其具有抗氧化活性[3]、抑菌活性[4]、促進(jìn)植物生長[5]、治療人類疾病[6]等作用。目前主要以化學(xué)法和酶解法制備褐藻寡糖，但化學(xué)法存在反應(yīng)條件難控制、產(chǎn)物難分離、殘留物質(zhì)難清除的問題，使得其應(yīng)用具有很大的局限性。酶解法因其具有較強的特異性、提取效率較高、反應(yīng)條件較溫和、降解過程比較容易控制等優(yōu)點將逐漸成為制備褐藻寡糖的主要方法[7]。

本研究采用茶文化與健康研究所篩選獲得的海洋來源黃桿菌B2 發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶，再以所得褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以體系中還原糖的生成量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對褐藻膠裂解酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高還原糖的生成量，并研究酶解制備的褐藻寡糖的ABTS+自由基清除能力、抑菌能力和對對蝦的多酚氧化酶活性的影響，為褐藻寡糖的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黃桿菌 （Flavobacterium）B2、假單胞菌（Pseudomonas）、希瓦氏菌（Shewanella）：由茶文化與健康研究所實驗室篩選并保藏；南美白對蝦（Penaeus vannamei）由福清市誼華水產(chǎn)食品有限公司提供，并于當(dāng)天?；钸\回實驗室。

1.1.2 試劑

三氯乙酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）和植酸（70%）、苯酚、硫酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉：英國OXOID 公司；海藻酸鈉（食品級）：Aladdin 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-70BS 型氣浴式恒溫?fù)u床：上海知楚儀器公司；JJ500 型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；TCL-20000cR 型高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；STARTER 2100 型pH 計：奧豪斯儀器有限公司；YXQLS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)設(shè)備廠；SYNERGY-H1 型酶標(biāo)儀：BioTek 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

2216E 培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母粉1.0 g，三氯化鐵0.01 g，用人工海水溶解并定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：海藻酸鈉5.0 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，pH 7.2，人工海水溶解并定容至1 000 mL，121 ℃ 滅菌 20 min。

1.3.2 制備褐藻膠裂解酶粗酶液并測定酶活

挑取單菌落的黃桿菌B2 接種于液體培養(yǎng)基2216E 中，震蕩培養(yǎng) 16 h（30 ℃、180 r/min），再以轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)基體積的3 %接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 36 h（30 ℃、180 r/min），離心（4 ℃、10 000 r/min）10 min，收集上清液。上清液在4 ℃條件下加硫酸銨至60 %飽和度，4 ℃靜置過夜，離心（4 ℃、11 000 r/min）10 min，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0、20 mmol/L）溶解并透析。透析后的樣品即粗酶液，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[8]測定酶活后于4 ℃貯藏備用。

1.3.3 單因素試驗

1）稱取一定質(zhì)量的褐藻酸鈉溶于磷酸鹽緩沖液（pH 8.0、20 mmol/L）中，配制成 2 g/L 的褐藻酸鈉溶液，從中取100mL溶液，加入20mL的粗酶液（酶活為21 U/mL）在 40 ℃下反應(yīng) 18 h，每 2 h 取 10mL酶解液，立即沸水浴10 min 終止反應(yīng)，測定還原糖生成量并計算褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率，以加入20mL滅活酶液作空白對照。

2）在反應(yīng)溫度 40 ℃、pH 8.0 條件下，研究不同底物濃度（2、4、6、8、10、12 g/L）在褐藻酸鈉水解過程中對還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

3）在底物濃度8 g/L、反應(yīng)溫度40 ℃條件下，研究不同酶解液 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）在褐藻酸鈉水解過程中對還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

4）在底物濃度 8 g/L、pH 8.0 的條件下，研究不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）在褐藻酸鈉水解過程中對還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗設(shè)計的自變量及水平。根據(jù)中心試驗設(shè)計（central composite design，CCD）原理，以還原糖生成量為指標(biāo)，選取溫度、pH 值兩個因素，設(shè)計兩因素五水平響應(yīng)面分析試驗，用響應(yīng)面分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，來確定最佳工藝參數(shù)。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 CCD 試驗設(shè)計因子及水平表Table 1 Factors and level of response surface central composite design

1.3.5 還原糖生成量測定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖生成量[8]。

1.3.6 轉(zhuǎn)化率測定

采用苯酚-硫酸法測定體系中的總糖濃度[9]，還原糖含量與總糖含量的比值，即為體系的轉(zhuǎn)化率。

1.3.7 ABTS+自由基清除活力

參照Wang 等[10]的方法進(jìn)行測定。蒸餾水作為空白組，維生素C 作為陽性對照，計算ABTS+自由基清除活力。

1.3.8 不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取褐藻寡糖的濃度梯度：4、6、8、10、12 g/L，以對對蝦腐敗菌假單胞菌和希瓦氏菌按體積比1∶1 混合的菌液的抑菌指數(shù)為考察指標(biāo)。按混合菌液體積的3%的比例將褐藻寡糖加入混合菌液后震蕩培養(yǎng)8 h，在600 nm 處測定吸光值，計算抑菌指數(shù)，確定各成分的最佳濃度。同時，設(shè)置無菌水為空白對照組，平行測定4 次。抑菌指數(shù)公式為：

式中：Acontrol表示空白組吸光值；Asample表示樣品組吸光值。

1.3.9 對蝦的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測定

將購買的對蝦，保活運回實驗室，加碎冰使其猝死，清洗干凈后，剔除肢體殘缺、顏色異常的個體；挑選大小一致的對蝦隨機放入預(yù)冷的蒸餾水中，避光浸泡1 h。瀝干后隨機分組放入自封袋中，放置（4±1）℃條件下貯藏。取20 只蝦頭，用液氮研磨至粉末，50 mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽溶液溶解，4 ℃離心30 min 得到的上清液即為PPO 粗酶液。測定酶活之前，預(yù)先在1mL酶液中分別加入100 μL 的褐藻寡糖、植酸（蒸餾水為空白對照）35 ℃孵育30 min，再于470 nm 處測定吸光值。多酚氧化酶的酶活測定參照González 等[11]的方法。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 及Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件單因素優(yōu)化

2.1.1 酶解時間對降解效果的影響

酶解時間對褐藻酸鈉水解效果的影響見圖1。

圖1 酶解時間對褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on sodium alginate hydrolysis

酶解時間影響酶解產(chǎn)物的得率，酶解時間太短，酶解反應(yīng)就不夠充分，當(dāng)酶解反應(yīng)已達(dá)到平衡時，增加酶解時間也不能明顯提高酶解產(chǎn)物的生成量和轉(zhuǎn)化率。由圖1 可知，酶解過程中，隨著時間的推移，酶解反應(yīng)還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率也隨之升高，酶解16 h 后，還原糖生成量及轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)，表明酶解16 h 時褐藻酸鈉基本已經(jīng)酶解為寡糖，繼續(xù)進(jìn)行酶解還原糖生成量和轉(zhuǎn)化率也不會增加太多，因此選擇16 h 為褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖的最佳酶解時間。

2.1.2 底物濃度對降解效果的影響

底物濃度對褐藻酸鈉水解效果的影響見圖2。

圖2 底物濃度對褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on sodium alginate hydrolysis

隨著底物濃度逐漸增大，還原糖生成量也不斷增加。當(dāng)?shù)孜餄舛仍鲋? g/L 時，褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，而后還原糖生成量和轉(zhuǎn)化率基本穩(wěn)定。這是因為褐藻酸鈉的水溶液具有高黏度特性，且溶液黏度呈幾何級數(shù)上升，在較高的底物濃度下，酶量明顯不足，不利于酶與底物的充分接觸[12]，減弱了酶解底物的速度，使還原糖的生成量和轉(zhuǎn)化率變低，因此選擇褐藻酸鈉濃度為8 g/L 為最佳底物濃度。

2.1.3 溫度對降解效果的影響

溫度對褐藻酸鈉水解效果的影響見圖3。

溫度能夠影響酶的活性，在酶解反應(yīng)中起很重要的作用。一定溫度范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高而升高，當(dāng)達(dá)到酶的最適溫度時，此時酶的酶活力達(dá)到最大，酶解效果最好；當(dāng)溫度逐漸升高超過了最適溫度時，酶蛋白質(zhì)會因為過高的溫度而變性失活，酶活力的降低，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)程。如圖3 所示，還原糖生成量及褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而升高，并在反應(yīng)溫度30 ℃時達(dá)到最大值；而當(dāng)溫度大于30 ℃，二者隨溫度的升高而降低。結(jié)果表明，褐藻膠裂解酶在30 ℃時酶活力最大，降解海藻酸鈉效果最好，故褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖的最佳反應(yīng)溫度應(yīng)選擇30 ℃。

圖3 溫度對褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperatures on sodium alginate hydrolysis

2.1.4 pH 值對降解效果的影響

pH 值對褐藻酸鈉水解效果的影響見圖4。

圖4 pH 值對褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.4 Effect of pH value on sodium alginate hydrolysis

圖4 表明褐藻膠裂解酶對pH 值變化敏感，當(dāng)pH值為8.0 時，還原糖生成量及褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，當(dāng)體系pH 值偏離最適pH 值時，二者都會出現(xiàn)不同程度地減小。這與酶自身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)，即酶在一定的pH 值范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大活力，當(dāng)酶處于最適pH 值時，其酶活力最大，酶解速度最快，酶解效果最好，偏離最適pH 值時，酶的活性中心構(gòu)像會產(chǎn)生一定的變化，甚至于改變了整個酶分子的結(jié)構(gòu)，從而使酶變性失活[13]，酶活力的下降，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)程，減弱了酶解速度，還原糖生成量及轉(zhuǎn)化率也大大下降，故最佳反應(yīng)pH 值應(yīng)為8.0。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得到，還原糖生成量或轉(zhuǎn)化率具有顯著差異的是pH 值和溫度。由于溫度和pH 值是褐藻膠裂解酶酶的特定屬性，酶活力對溫度和pH 值較為敏感，當(dāng)溫度和pH 值改變時，可能會導(dǎo)致酶失活，因此選擇這兩個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。優(yōu)化試驗設(shè)計采用響應(yīng)面法（RSM），所用軟件為Design-Expert 8.0.6，實施模型為中心組合設(shè)計。響應(yīng)面CCD 設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface design and corresponding results

利用軟件進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值Y 還原糖生成量的多項式回歸模型為：Y=1 648.37+163.86A+30.17B-62.87AB-215.54A2-52.98B2，對結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 中心組合試驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance（ANOVA）of central composite design

回歸方程方差分析顯示，模型的P＜0.000 1 說明該模型顯著，失擬項P=0.090 5＞0.05，表明失擬不顯著，模型沒有失擬現(xiàn)象，說明該模型的選擇是合理可行的。決定系數(shù)R2=0.981 5，說明實測值和預(yù)測值擬合度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.968 4，表明僅有總變異的不到4%不能由該模型解釋；本試驗變異系數(shù)=2.63%，說明試驗結(jié)果可靠。精密度為35.425 大于4，說明該模型可以對試驗結(jié)果進(jìn)行擬合。

響應(yīng)面各試驗點預(yù)測值和真實值線性關(guān)系見圖5。

圖5 響應(yīng)面各試驗點預(yù)測值和真實值線性關(guān)系圖Fig.5 Linear correlation plot between predicted and actual values of tannasecontent of response surface model

如圖5 所示，軟件擬合的響應(yīng)面各試驗點預(yù)測值和真實值擬合程度良好。該擬合方程為褐藻膠裂解酶水解制備褐藻寡糖提供了一個合適的模型，可用此模型代替真實試驗點對酶解反應(yīng)進(jìn)行分析和預(yù)測。

根據(jù)上述擬合的回歸方程，利用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制出的三維響應(yīng)面及與之對應(yīng)的等高線圖見圖6。

圖6 的溫度和體系pH 值對還原糖生成量的影響的響應(yīng)面及等高線圖能比較直觀地解釋各變量之間對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱。圖6 顯示了溫度和體系pH 值對還原糖生成量的影響。當(dāng)溫度不變時，還原糖生成量會隨體系pH 值的增大出現(xiàn)先增大后降低的趨勢；當(dāng)體系pH值不變時，還原糖生成量同樣會出現(xiàn)先增大再降低的趨勢。因此預(yù)測該試驗存在一個最大值，通過Design-Expert 8.0.6 軟件預(yù)測還原糖生成量的最大值為1 680 mg/L，最佳試驗條件是體系pH 值為8.37，溫度為30.65 ℃。

圖6 體系pH 值和溫度對還原糖生成量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface curves and contour plots of interaction effect between enzyme dosage and pH value

2.3 驗證試驗

根據(jù)以上最佳工藝條件，取實際可控的條件：體系pH 8.4、酶解溫度30 ℃、底物質(zhì)量濃度8 g/L，該條件下酶解制備褐藻寡糖，經(jīng)測定，其還原糖生成量為1 660 mg/L。略低于響應(yīng)面試驗的預(yù)測值，但誤差僅在1.20%之間，證明了響應(yīng)面所得的模型及最佳條件的可靠性。

2.4 褐藻寡糖對ABTS+自由基的清除能力

ABTS 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┤邕^硫酸鉀氧化作用下會形成藍(lán)綠色的單陽離子自由基（ABTS+自由基），當(dāng)抗氧化劑存在時，ABTS+自由基的產(chǎn)生將受到抑制。表4可以看出，褐藻寡糖表現(xiàn)出良好的清除活性，清除能力隨著濃度的升高而增強。且當(dāng)濃度增至5.0 g/L 時，達(dá)到與維生素C 同等的清除效果。對蝦腐敗的原因之一是由于氧氣的作用，結(jié)果表明酶解得到的褐藻寡糖有較強的抗氧化能力，因此褐藻寡糖可以減少氧化作用延長對蝦的貨架期。

表4 褐藻寡糖對ABTS+自由基清除活性Table 4 Scavenging effect of alginate oligosaccharides on ABTS+

2.5 不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)

不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)見圖7。

圖7 不同濃度褐藻寡糖的抑菌指數(shù)Fig.7 Different concentrations of alginate oligosaccharide antibacterial index

從圖7 可知，當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到8 g/L 時，對對蝦的腐敗菌的抑菌指數(shù)達(dá)到了最大；隨著褐藻寡糖濃度的增加，抑菌指數(shù)變低的原因可能是由于褐藻膠裂解酶的降解能力具有一定的限度，對底物海藻酸鈉降解不完全，而海藻酸鈉可以作為碳源促進(jìn)對蝦腐敗菌的生長，削弱了褐藻寡糖的抑菌效果。綜合以上分析，選擇褐藻寡糖濃度為8 g/L 時對對蝦的腐敗菌希瓦氏菌和假單胞菌的抑菌能力最大，抑菌效果最好。

2.6 褐藻寡糖對對蝦蝦頭PPO活性影響

各物質(zhì)對對蝦蝦頭PPO 活性的影響見圖8。

圖8 各物質(zhì)對對蝦蝦頭PPO 活性的影響Fig.8 Effect of different material on PPO activity

由圖8 可知，向PPO 粗酶液中添加褐藻寡糖、植酸后PPO 活性顯著低于對照組，表明這2 種物質(zhì)可以有效抑制多酚氧化酶活性。由于PPO 可以誘導(dǎo)蝦體內(nèi)的無色一元酚與氧氣接觸，逐步氧化成有色醌類物質(zhì)，造成褐變，因此保鮮劑中含有褐藻寡糖或植酸這兩種物質(zhì)可以減輕對蝦的褐變反應(yīng)，提高感官評價分值。

3 結(jié)論

本試驗利用單因素與響應(yīng)面相結(jié)合的方法對褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳的酶解條件為：體系pH 8.4、酶解溫度30 ℃、底物質(zhì)量濃度8 g/L，該條件下還原糖生成量達(dá)到1 660 mg/L，比優(yōu)化前提高了64.9%。當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到5.0 g/L時，可達(dá)到與維生素C 同等的ABTS+自由基清除效果，表明褐藻寡糖具有較強的抗氧化作用，當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到8 g/L 時，對對蝦的腐敗菌希瓦氏菌和假單胞菌的抑菌指數(shù)達(dá)到了最大，表明褐藻寡糖對對蝦的腐敗菌生長具有一定的抑制作用，將其作用于蝦頭中提取的多酚氧化酶發(fā)現(xiàn)能有效的抑制多酚氧化酶的活性，為酶解褐藻酸鈉制備的褐藻寡糖的開發(fā)和對對蝦的貯藏保鮮研究提供了理論依據(jù)。