劉袆帆，梁嘉熹，王琴

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510000）

金柚栽培歷史悠久，品種眾多，產(chǎn)量高，目前在廣東梅州等地大量種植[1]。柚皮是柚子食用和加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，占單果質(zhì)量的40%～50%，但目前加工方法除柚皮果脯外，大部分柚皮被廢棄，造成資源的極大浪費(fèi)。柚皮含果膠、黃酮、萜類(lèi)等多種生物活性成分。柚子皮和囊衣中較多存在天然的一種植物黃酮——柚皮苷[2]，它是一種雙氫黃酮類(lèi)化合物[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，柚皮苷具有多種生物活性，包括抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抑菌、改善微循環(huán)、降低毛細(xì)血管的脆性等[4]。董媛琪等[5]指出，柚皮苷對(duì)自由基具有一定的清除作用。Tian 等[6]利用柚子皮醇溶液發(fā)酵提高黃酮含量，指出黃酮化合物變化與抗氧化能力相一致。Guo等[7]從4 種柑橘類(lèi)植物中測(cè)定黃酮含量，發(fā)現(xiàn)奉節(jié)臍橙漿黃酮類(lèi)化合物含量最高，綜合抗氧化活性高，活性氧清除能力強(qiáng)。目前，柚皮苷在醫(yī)藥、食品及化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2]，可作為天然色素、風(fēng)味改良劑和苦味劑等在食品中用于生產(chǎn)[8]，也可作為合成高甜度、無(wú)毒性、能量較低的新型甜味劑的二氫柚苷查耳酮的原料。

柚皮苷的傳統(tǒng)提取方法為熱水提取法，堿提酸沉法，有機(jī)溶劑提取法，另外，還有超聲波輔助提取，微波輔助提取，超臨界二氧化碳提取等高新技術(shù)。常規(guī)傳統(tǒng)的提取法效率較低，溶劑耗費(fèi)比較多，提取比較耗時(shí)[9]。陳源等[10]以葡萄柚為原料，采用微波輔助提取技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其中柚皮苷的提取率為5.94%。洪曉婷等[11]利用超聲波輔助技術(shù)提取沙田柚皮的柚皮苷，其含量達(dá)33.8 mg/g。陳欲云等[12]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化沙田柚皮柚皮苷的提取條件，該提取率達(dá)6%。采用超聲波輔助提取，優(yōu)點(diǎn)在于提高介質(zhì)的穿透力和增大分子的運(yùn)動(dòng)速度，從而提高產(chǎn)品得率，減少溶劑的消耗，提高提取的效率，降低成本，適應(yīng)范圍比較廣[13]。因此，綜合以上優(yōu)點(diǎn)，超聲波輔助提取能為試驗(yàn)提供高效、便捷的方法。

本研究采用超聲波輔助浸提技術(shù)，優(yōu)化提取金柚柚皮中的柚皮苷，首先采用單因素與響應(yīng)面分析確定柚皮中柚皮苷提取的最優(yōu)工藝條件，隨后通過(guò)比對(duì)柚皮苷提取物的體外抗氧化活性，包括1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除力，2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]自由基清除能力，F(xiàn)e3+還原力；同時(shí)選用經(jīng)2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2'-azobis-2-methyl-propanimidamide，AAPH）自由基誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血模型，來(lái)評(píng)估金柚柚皮中柚皮苷提取物的抗氧化能力，為金柚柚皮的綜合利用的開(kāi)發(fā)尋找有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金柚柚子：采購(gòu)于深圳百果園實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、一縮二乙二醇、氫氧化鈉、磷酸緩沖溶液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸、DPPH、ABTS、過(guò)硫酸鉀、無(wú)水乙醇、AAPH：均為分析純，廣州齊云生物技術(shù)公司。紅細(xì)胞來(lái)源于3 位志愿者血液。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y 型高速粉碎機(jī)：安陽(yáng)市博宇醫(yī)療器械有限公司；DHG-9013A 型恒溫烘箱：上海善志有限公司；SLSM 型超聲-波微波反應(yīng)系統(tǒng)：天津先歐公司；HH-1 型恒溫水浴鍋：山東東易日盛儀器有限公司；SPECORD50型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮苷提取

將金柚柚皮洗凈，瀝水，取外皮，去除外皮黑點(diǎn)以及損傷部分，剪碎成1 cm2左右，烘干約12 h 至恒重，柚皮要求呈干硬無(wú)疏松狀。粉碎機(jī)研磨5 min，過(guò)80 目篩，得柚皮粉，密封，放干燥器備用，精確稱(chēng)取。稱(chēng)取適量的柚皮粉，置于超聲波提取容器中，加入一定體積乙醇溶液，設(shè)定超聲功率及時(shí)間，超聲提取操作后取出，使用抽濾機(jī)抽濾，棄濾渣，待用。

1.3.2 柚皮苷提取物含量測(cè)定

本試驗(yàn)采取戴維斯法[14]測(cè)定柚皮中的柚皮苷提取物含量。吸取待用濾液樣品0.1mL于10mL比色皿中，依次加入體積分?jǐn)?shù)為90%的一縮二乙二醇溶液5 mL和4 mol/L NaOH 溶液0.1 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，40 ℃水浴10 min，冷卻后，以空白對(duì)照作參比，于420 nm 檢測(cè)反應(yīng)液吸光度，記錄并計(jì)算樣品液濃度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確稱(chēng)量5.0 mg 的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，得到0.10 mg/mL 的柚皮苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液[11]，依次精密地稱(chēng)取0.10mg/mL 的柚皮苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5mL于 10mL的比色管中，依次加入體積分?jǐn)?shù)為90%的一縮二乙二醇5 mL和4 mol/LNaOH 0.1mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，40 ℃水浴10 min，冷卻后以空白液作參比，于420 nm 檢測(cè)反應(yīng)液吸光度，以濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算柚皮苷提取物含量。

1.3.4 柚皮苷提取量的計(jì)算

將測(cè)定的樣品測(cè)出的吸光值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度。

式中：C 表示樣品液濃度，mg/mL；V 表示溶劑體積，mL；M 表示柚皮粉質(zhì)量，mg。

1.3.5 柚皮苷提取物單因素試驗(yàn)研究

選取不同的提取時(shí)間、料液比、超聲波功率作為提取率的影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

料液比的影響：設(shè)定提取時(shí)間為30 min，超聲波功率為 500 W，1∶16、1∶20、1∶24、1∶26、1∶28（g/mL）的料液比考察對(duì)提取率的影響，重復(fù)3 次試驗(yàn)，取平均值。

提取時(shí)間的影響：設(shè)定超聲波功率為500 W，料液比為 1∶20（g/mL），40、50、60、70、80 min 的提取時(shí)間考察對(duì)提取率的影響，重復(fù)3 次試驗(yàn)，取平均值。

超聲功率的影響：設(shè)定提取時(shí)間為30 min，料液比為 1∶20（g/mL），以 300、400、500、600、700 W 的超聲功率考察對(duì)提取率的影響，重復(fù)3 次試驗(yàn)，取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面法分析優(yōu)化柚皮苷提取物提取工藝

在3 個(gè)單因素研究基礎(chǔ)上，選定三因素三水平運(yùn)用Design-Expert8.0 的方法，以柚皮苷提取物含量作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，篩選出最佳提取工藝。

1.3.7 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH 自由基清除能力

取1mL樣品液，加上4mL的0.12 mmol/L DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，離心10 min，用95%乙醇作參比，在517 nm 下測(cè)量吸光度A1，無(wú)水乙醇吸光值為A2，用相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對(duì)照，吸光值為A0[15]。同時(shí)用相同濃度的VC作為控制對(duì)照組，計(jì)算清除率。

式中：A1為樣品測(cè)定吸光值；A2為無(wú)水乙醇吸光值；A0為相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對(duì)照吸光值。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力

5mL7mmol/L 的 ABTS 溶液和 5mL2.45 mmol/L的K2S2O8溶液避光反應(yīng)12 h 生成ABTS+使用液，該使用液提前一天配制，且必須當(dāng)天使用，使用前用無(wú)水乙醇稀釋到吸光值在732 nm 處為0.70±0.02。取0.4mL不同濃度的樣品溶液于試管中，加入3mLABTS+使用液，室溫（25 ℃）下避光反應(yīng) 30 min，于 732 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，無(wú)水乙醇代替ABTS+使用液扣除樣品溶液的本底吸收，吸光值為A2，用相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對(duì)照，吸光值為A0[16]。同時(shí)用相同濃度的VC作為控制對(duì)照組，計(jì)算清除率。

式中：A1為樣品測(cè)定吸光值；A2為無(wú)水乙醇代替ABTS+使用液扣除樣品溶液的本底吸光值；A0為相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對(duì)照吸光值。

1.3.7.3 鐵離子還原力

樣品液1 mL，加上0.2 mol/L 磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀各2.5 mL，混合后在50 ℃20 min，冷卻后加體積分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，離心，10 min 后取2.5mL試液，加2.5mL水，1mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%FeCl3，10 min 后在 700 nm 處測(cè)吸光值，以相同濃度的VC為對(duì)照。

1.3.8 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)

取1.5mL的紅細(xì)胞懸液于2mL的離心管中，在4 ℃條件下1 200 r/min 離心5 min，去除上清液，加入1.5mL的磷酸緩沖溶液將紅細(xì)胞重懸后再次進(jìn)行離心，該步驟重復(fù)3 次，以除去紅細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片，得到結(jié)構(gòu)完整的紅細(xì)胞沉淀，將沉淀紅細(xì)胞用PBS配制成體積比為6%的紅細(xì)胞懸液備用。取6%的紅細(xì)胞懸液0.2mL分別加入3 支5mL的離心管中，第一支離心管中加入0.2mL樣品，第二支試管中加入0.2mL樣品，第三支試管中加入0.2mLPBS（pH 值為7.4），置于37 ℃搖床中，避光緩慢震蕩30 min，第一支離心管中加入0.4 mLAAPH，第二支試管中加入0.4mLPBS（pH 值為 7.4），第三支試管中加入 0.4mLAAPH，置于37 ℃搖床中，避光緩慢震蕩2 h，在3 支離心管中加入3.2mL的 PBS（pH 值為 7.4），在 4 ℃條件下 1 2 00 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定540 nm 處的吸光值，記為A。取6%的紅細(xì)胞懸液0.2mL加入5mL的離心管中，加入3.8mL的超純水，置于37 ℃搖床中，避光緩慢震蕩 2.5 h，在 4 ℃條件下 1 200 r/min 離心 10 min，取上清液測(cè)定540 nm 處的吸光值，記為B[17-18]。

式中：A 為樣品吸光值；B 為空白對(duì)照組吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均做3 次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析和Tukey's multiple range test 進(jìn)行顯著性分析（p＜0.05 表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值與濃度的線性回歸方程式是y=25.002x-0.004 5，y 軸為吸光值，x 軸為柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度mg/mL，相關(guān)關(guān)系為系數(shù)為R2=0.999 3，表明線性關(guān)系良好，柚皮苷提取物含量測(cè)定能根據(jù)此曲線計(jì)算得到。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 料液比的影響

料液比對(duì)柚皮苷提取率影響如圖2 所示。

圖2 料液比對(duì)柚皮苷提取物提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of naringin extraction

根據(jù)溶劑的種類(lèi)和用量不同會(huì)影響溶劑自身極性，溶出成分對(duì)組織作用影響與溶劑極性有關(guān)。不同料液比對(duì)柚皮苷提取物有明顯差異。在同一時(shí)間，同一超聲功率下，不同的料液比呈先緩慢增加，后逐漸減少趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶26（g/mL）時(shí)達(dá)到峰值，提取率為 2.4%。因此，1∶26（g/mL）為最佳料液比。

2.2.2 提取時(shí)間的影響

提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)柚皮苷提取物提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction rate of naringin extraction

根據(jù)圖3 所示，提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，提取率為縱坐標(biāo)。其他條件控制不變下，在40 min～50 min 時(shí)曲線趨勢(shì)稍緩慢，在超聲波系統(tǒng)中充分浸漬下，在50 min～60 min 時(shí)曲線趨勢(shì)增長(zhǎng)顯著，在70 min 時(shí)達(dá)到峰值，提取率為2.5%。經(jīng)分析認(rèn)為，超聲波伴隨能量，隨著時(shí)間越長(zhǎng)，組織作用大，其他成分含量變化較多，積累的能量會(huì)影響柚皮苷提取物溶出。故將提取時(shí)間設(shè)置為70 min 最合適。

2.2.3 超聲功率的影響

功率對(duì)柚皮苷提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 功率對(duì)柚皮苷提取率的影響Fig.4 Effect of power on extraction rate of naringin extraction

由圖4 可看出，在其他條件不變下，超聲功率變化明顯，在功率為300 W～600 W 時(shí)提取率顯著上升。在功率為600 W 達(dá)到峰值，峰值時(shí)，提取率為2.6%。提取過(guò)程中由于超聲波的機(jī)械作用，空化作用引起的強(qiáng)烈震動(dòng)，使得細(xì)胞壁被擊破，有利于有效成分的溶出。當(dāng)功率增大時(shí)，由于震動(dòng)作用多于強(qiáng)烈，溶解的雜質(zhì)也隨即增加，影響提取率[19]。因此，超聲波功率設(shè)置為600 W 最合適。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面因素選取及方法

綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選定提取功率，料液比，提取時(shí)間3 個(gè)因素作為響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，利用Design-Expert8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合優(yōu)化柚皮苷提取物的提取工藝。設(shè)計(jì)試驗(yàn)的水平及因素如表1 所示。

表1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)的水平及因素Table 1 Level and factors of design experiment

以A、B、C 為自變量，以柚皮苷提取物提取率為響應(yīng)值（Y），試驗(yàn)方案如下表2。其中，1 號(hào)～12 號(hào)試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，13 號(hào)～15 號(hào)為中心試驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案Table 2 Response surface experimental scheme

2.3.2 二次方程模型建立

根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)的結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert8.0 軟件進(jìn)性回歸擬合分析得到各提取條件和柚皮苷提取物提取率之間的二次多項(xiàng)式方程模型為：

Y=3.33+0.22A+0.07B-0.16C+0.10AB+0.08AC-0.02BC-0.71A2-0.22B2+0.28C2

該方程各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小直接反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[20]。由方程一次項(xiàng)系數(shù)可知，影響柚皮苷提取物的提取量的因素為A＞C＞B。顯然，影響因素主要是提取時(shí)間，其次是料液比，最后是超聲波功率。

2.3.3 方差分析及結(jié)果

運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)響應(yīng)面的結(jié)果分析和所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果如下表3 所示。

表3 響應(yīng)面的結(jié)果分析Table 3 Result analysis of response surface

根據(jù)上表中的分析結(jié)果可知，整體模型p 值為0.011 9，模型為顯著。因受各實(shí)際條件，原材料影響，各試驗(yàn)號(hào)存在誤差。在此情況下，R2=0.944 1，體現(xiàn)理論預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)測(cè)定值具有很好的相關(guān)性。Adjusted R2=0.843 4 說(shuō)明該模型適合用來(lái)進(jìn)行柚皮苷提取物提取率的響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。在各因素中，一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)A2對(duì)提取效果有很大影響，而一次項(xiàng)B 和C 顯著性不高，交互項(xiàng)AB，AC 和BC 并不顯著。

2.3.4 等高線和響應(yīng)面圖

根據(jù)響應(yīng)面值的各因素影響下，能得出一個(gè)通過(guò)模型的所展示的三維結(jié)構(gòu)圖。對(duì)比AC 和BC 的交互作用，AB 之間因素交互效果最好，因此針對(duì)AB 之間的因素做出分析。時(shí)間A 與功率B 交互作用影響提取率的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 時(shí)間與功率交互作用影響提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the effects of time and ultrasonic power on the naringin extraction

在圖5 中，能直觀地反應(yīng)各因素對(duì)于提取率的影響，能找出最佳參數(shù)，并能預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值，可輔助判斷各變量間的相互作用。曲線越陡，反映出響應(yīng)值在此操作條件下越敏感，若相對(duì)平滑，則反之。從圖5 中可看出時(shí)間曲線相對(duì)陡峭，時(shí)間的p 值也達(dá)到相對(duì)顯著的水平。

時(shí)間與功率響應(yīng)面分析等高線圖見(jiàn)圖6。

圖6 時(shí)間與功率響應(yīng)面分析等高線圖Fig.6 Contour plots for the effects of time and ultrasonic power on the naringin extraction

等高線的中心點(diǎn)為響應(yīng)面值的最高值，隨時(shí)間變化先上升后下降，隨功率增加，也是先上升后下降，在約71 min，600 W 超聲波功率的到極值。等高線的形狀也可以看出時(shí)間和功率兩因素之間交互關(guān)系，等高線呈橢圓形，證明這兩因素間交互效果佳。

2.3.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)及結(jié)果

響應(yīng)面圖成山丘型曲面，柚皮苷提取物提取率能得最大值。經(jīng)分析，獲得最佳條件是時(shí)間為71.36 min，功率 618.726 W，料液比約為 1∶27.8（g/mL），所預(yù)測(cè)的柚皮苷提取物提取率為3.803%。由于考慮實(shí)際操作與設(shè)備條件關(guān)系，把條件取相近數(shù)值，時(shí)間為71 min，功率為600 W，料液比為1∶28（g/mL）。為檢驗(yàn)此方法的可靠性，在此條件下進(jìn)行柚皮苷提取物提取3 次，并取平均值，得出相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。根據(jù)響應(yīng)面分析法得到的最佳提取條件，預(yù)測(cè)提取率為3.803%。所得最佳條件為進(jìn)行3 次試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)記錄如表4 所示。

表4 驗(yàn)證結(jié)果記錄Table 4 Verification result records

根據(jù)上表所示，所測(cè)得的理論值與3 組驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值基本符合，誤差較小，可靠性高。測(cè)定的結(jié)果穩(wěn)定，具有一定實(shí)際價(jià)值，對(duì)于柚皮苷提取物的提取工藝有一定的意義。

2.4 DPPH自由基清除能力

柚皮苷提取物和VC的DPPH 自由基清除能力如圖7 所示。

圖7 DPPH 自由基清除率Fig.7 DPPH free radical clearance rate

隨著VC隨濃度變化，清除率相對(duì)變化。當(dāng)柚皮苷提取物濃度為10 μg/mL 時(shí)，清除率最高。不同濃度柚皮苷提取物對(duì)于DPPH 自由基清除率總體趨勢(shì)相對(duì)平緩。柚皮苷提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力的IC50值為31.61 mg/mL。由于黃酮化合物中B 環(huán)的臨位酚羥基是抗氧化性的影響基團(tuán)，存在B-3′-OH 和B-5′-OH 能使抗氧化活性增加，而柚皮苷中缺少此基團(tuán)，因此抗氧化效果差于 VC[3，21]。

2.5 ABTS+自由基清除能力

柚皮苷提取物和VC對(duì)ABTS+自由基清除能力如圖8 所示。

圖8 ABTS+自由基清除率Fig.8 ABTS+free radical clearance rate

ABTS+自由基的清除能力隨著柚皮苷提取物濃度變化而變化。當(dāng)柚皮苷提取物濃度在8 μg/mL 時(shí)，它對(duì)ABTS+自由基的清除能力就達(dá)到最大。由圖可以看出在濃度范圍為 2 μg/mL～6 μg/mL 時(shí)，對(duì) ABTS+自由基的清除能力柚皮苷提取物強(qiáng)于VC。當(dāng)濃度高于8 μg/mL時(shí)，柚皮苷提取物的ABTS+自由基清除能力稍弱于VC。柚皮苷提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力的IC50值為 26.76 μg/mL。

2.6 Fe3+還原能力

還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)[22]。柚皮苷提取物和VC對(duì)Fe3+還原能力見(jiàn)圖9。

圖9 Fe3+還原力Fig.9 Fe3+reducing power

在 2 μg/mL～10 μg/mL 的范圍里，柚皮苷提取物的Fe3+還原能力弱于VC。由圖可知，F(xiàn)e3+還原能力隨著柚皮苷提取物與VC濃度增大而增大。

2.7 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)

柚皮苷提取物溶血率如圖10。

圖10 柚皮苷提取物對(duì)AAPH 誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血情況Fig.10 Hemolysis of erythrocytes induced by AAPH induced by naringin extract

隨著柚皮苷提取物濃度升高，溶血率越低。紅細(xì)胞溶血率隨著柚皮苷提取物濃度降低而降低。由于紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易受到自由基侵害體內(nèi)細(xì)胞，從而發(fā)生氧化溶血[23]。試驗(yàn)中加入柚皮苷提取物能降低紅細(xì)胞溶血率，說(shuō)明在此條件下，柚皮苷提取物具有良好的保護(hù)機(jī)制。柚皮苷的IC50值為1.819 μg/mL，對(duì)于紅細(xì)胞溶血有一定的作用，具有抗氧化功能。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法對(duì)超聲波輔助提取金柚柚皮中的柚皮苷提取物工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，通過(guò)單因素的考察，研究提取過(guò)程中提取時(shí)間，料液比，超聲波輔助提取功率對(duì)柚皮苷提取物提取率的影響。再根據(jù)單因素試驗(yàn)選取影響較大的水平，采用了響應(yīng)面分析法，并分析各因素的顯著性和交互作用及其響應(yīng)值，篩選出最佳提取工藝。在該過(guò)程中，選用紫外分光光度計(jì)測(cè)定柚皮苷提取物的含量，通過(guò)戴維斯法進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定柚皮苷提取物有效成分的含量。在時(shí)間為 71 min，功率為 600 W，料液比為 1∶28（g/mL）條件下，測(cè)量的柚皮苷提取物提取率為3.8%，與預(yù)測(cè)的提取率為3.803%相近。證明在此方法中，能通過(guò)響應(yīng)面的方法優(yōu)化試驗(yàn)條件，從而大大降低提取液的消耗，增加提取效率。

通過(guò)柚皮苷提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，F(xiàn)e3+還原能力，這3 種自由基體系中得出柚皮苷提取物具有抗氧化能力。通過(guò)經(jīng)AAPH 誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血模型中，柚皮苷提取物的有一定程度捕獲AAPH 自由基的能力，從而保護(hù)紅細(xì)胞，為研究柚皮苷的有效開(kāi)發(fā)具有一定意義。