孟 駿,汪 芳,孫 璐,陳俊伸,沈新春

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,現(xiàn)代糧食流通 與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

長(zhǎng)期以來(lái),大豆一直是亞洲地區(qū)人們的主要副食,大豆制品如豆腐、豆?jié){、豆干等,食味鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,是東亞國(guó)家的傳統(tǒng)食品[1]。其中豆?jié){因?yàn)榫哂懈叩鞍?富含亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等人體必需脂肪酸等優(yōu)點(diǎn),更加受到消費(fèi)者的青睞。

豆?jié){的風(fēng)味特性受多種因素影響,不同大豆品種,種植環(huán)境,加工工藝都會(huì)影響豆?jié){的風(fēng)味。傳統(tǒng)對(duì)于豆?jié){風(fēng)味的分析多采用感官評(píng)價(jià)的方法[2],感官評(píng)價(jià)能較客觀地反映人類對(duì)于相關(guān)食品的味覺(jué),嗅覺(jué)和視覺(jué)感受,但其存在重現(xiàn)性較差,個(gè)體差異大等缺點(diǎn)。而電子舌技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種分析、識(shí)別液體“味道”的新型檢測(cè)技術(shù)[3]。其優(yōu)點(diǎn)尤為突出:首先,待測(cè)樣品不需經(jīng)過(guò)任何前處理,其次,檢測(cè)速度快,從樣品檢測(cè)開(kāi)始到完成只需要花費(fèi)幾十秒到幾分鐘的時(shí)間。同時(shí),電子舌具有較高的靈敏度和重復(fù)性,測(cè)量結(jié)果可靠,從而避免了在感官評(píng)價(jià)中因?yàn)椴煌巳旱闹饔^傾向性造成的誤差[4]。

豆?jié){的主要風(fēng)味為甜味和苦味,據(jù)報(bào)道,豆?jié){中的苦味主要是由于大豆種子中的酚酸、異黃酮、皂苷以及脂肪氧化酶或不飽和脂肪酸的氧化酸敗引起[5-9]。豆?jié){的甜味除了和大豆中的糖類物質(zhì)有關(guān),也和大豆中的其他組分有密切的關(guān)系。氨基酸作為重要的呈味物質(zhì)[10-11],廣泛存在于大豆種子中,有研究指出,氨基酸種類和含量影響著食品的風(fēng)味[12-13]。而有關(guān)大豆蛋白質(zhì)、氨基酸組成對(duì)豆?jié){甜味的研究鮮有報(bào)道,這將阻礙育種專家選育用于豆?jié){加工的專用大豆品種,因此,有必要從大豆原料的蛋白質(zhì)、氨基酸組成層面上研究它與豆?jié){甜度之間的關(guān)系。

本文采用電子舌分析了豆?jié){的甜味屬性,并檢測(cè)了大豆原料中的蛋白質(zhì)及氨基酸組成,通過(guò)相關(guān)性分析和回歸分析建立了基于大豆蛋白質(zhì)和氨基酸組成的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型,并期望通過(guò)此模型快速地預(yù)測(cè)未知大豆品種加工成豆?jié){的甜度,達(dá)到為豆?jié){生產(chǎn)篩選優(yōu)質(zhì)的大豆種子,為豆?jié){加工的原料優(yōu)化提供理論依據(jù)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)選取36種大豆原料 均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供，這些試驗(yàn)品種種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站,并于2015年秋收獲,從36種大豆原料中隨機(jī)選擇30種用于預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建,剩余的6種用于預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證,具體品種名稱見(jiàn)表1；PBS緩沖液、樣品緩沖液、4%～15%變性蛋白梯度分離膠、考馬斯亮藍(lán)G-250染色液、電泳脫色液、截留分子量3500 Da透析袋、11～180 kDa蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司;石油醚、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸銅、硫酸鉀等 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 36個(gè)大豆品種Table 1 36 soybean varieties

高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;SL-N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;AD-G858攪拌機(jī) 深圳正向電器實(shí)業(yè)有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;K-360全自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士Buchi公司;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 中國(guó)天美科學(xué)儀器有限公司;小型垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;ASTREE電子舌 法國(guó)Alpha MOS公司;THZ-C恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;H1850R離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司;ALPHA 1-4/2-4 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆蛋白質(zhì)及氨基酸含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5-2016進(jìn)行測(cè)定[14];水溶性蛋白含量的測(cè)定參照NY/T 1205-2006進(jìn)行測(cè)定[15];氨基酸含量參照GB 5009.124-2016,使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.2 大豆蛋白亞基組成分析

1.2.2.1 脫脂豆粉的制備 將不同品種的大豆種子經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩,所得的豆粉與石油醚按照1∶8的比例(質(zhì)量體積比)在具塞錐形瓶中混合,放入恒溫振蕩器中以25 ℃的條件振蕩8 h,靜置1 h待混合液分層后棄去上清液,保留豆粉;重復(fù)加入石油醚,25 ℃振蕩8 h,靜置1 h后棄去上清液3次,最后將剩余脫脂豆粉風(fēng)干,即得到脫脂豆粉,-20 ℃保存。

1.2.2.2 大豆分離蛋白的提取 參考李淑芬等[17]的方法,提取大豆分離蛋白,具體操作為:將脫脂大豆粉與蒸餾水按1∶10的比例(質(zhì)量體積比)混合,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0,40 ℃恒溫?cái)嚢?0 min,將懸浮液在4 ℃,3100×g條件下離心20 min,取上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至4.5,將懸浮液在4 ℃,3100×g條件下離心20 min,取沉淀復(fù)溶于蒸餾水中,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0,透析24 h,冷凍干燥后得大豆分離蛋白。

1.2.2.3 SDS-PAGE分析 將大豆分離蛋白與1 mol/L PBS溶液配制成濃度為2 mg/mL的溶液,并按4∶1的比例與樣品緩沖液混合(樣品緩沖液包含12.5% Tris-HCl,5%巰基乙醇,10% SDS,50%甘油,0.5%溴酚藍(lán)),90～95 ℃水浴加熱5 min,冷卻至室溫后將5.0 μL溶液加載到4%～15%的梯度分離膠中,在120 V的電壓下進(jìn)行SDS-PAGE直到溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的底部邊緣[18]。電泳結(jié)束后,使用考馬斯亮藍(lán)G-250(0.1%)染色,然后在脫色液中(10%甲醇,10%乙酸)脫色直到條帶清晰。采用Image LabTMAnalysis Software軟件對(duì)11S(大豆球蛋白)、7S(β-伴大豆球蛋白)以及相應(yīng)亞基(α′亞基、α亞基、β亞基、A3亞基、酸性亞基組AS、堿性亞基組BS)的含量進(jìn)行定量分析。

1.2.3 豆?jié){的制備 采用傳統(tǒng)的豆?jié){加工方法[19],將100 g大豆種子在室溫下漂洗,并在300 mL蒸餾水中浸泡10 h,將浸泡過(guò)的大豆種子瀝干,以8倍大豆質(zhì)量的水進(jìn)行磨漿,所得豆?jié){經(jīng)過(guò)150目篩過(guò)濾后,加熱至沸騰并保持5 min,即得試驗(yàn)所用鮮豆?jié){。

1.2.4 豆?jié){甜味電子舌分析 將20 mL不同品種大豆制成的鮮豆?jié){轉(zhuǎn)移至電子舌專用樣品燒杯中,樣品與校準(zhǔn)溶液(超純水)交替檢測(cè)。甜味的檢測(cè)方法采用標(biāo)準(zhǔn)添加的方法,具體操作為:選取5份20 mL同一品種大豆種子所制成的鮮豆?jié){,依次向每份鮮豆?jié){中加入0.0、0.4、1.0、2.0、4.0 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖,使每份鮮豆?jié){中的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度分別為0.00、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/mL,將5份添加有不同濃度葡萄糖的鮮豆?jié){選擇為標(biāo)準(zhǔn)添加物(Standard addition products),與其他不添加葡萄糖的鮮豆?jié){樣品共同進(jìn)行味覺(jué)分析。各樣品平行測(cè)定6次,選取較穩(wěn)定的后3次測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5 豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型的建立 利用SPSS 22.0軟件,采用回歸分析的方法將豆?jié){甜度值與大豆種子蛋白質(zhì)及氨基酸含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。首先將36個(gè)用于建立豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型的樣品分為兩組,第一組隨機(jī)選取30種樣品(總樣本數(shù)的83%)用于構(gòu)建豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型,第二組將剩余的6種樣品(總樣本數(shù)的17%)作為驗(yàn)證模型可靠性的測(cè)試樣品集。利用建立的模型對(duì)6個(gè)測(cè)試樣本集進(jìn)行預(yù)測(cè),比較預(yù)測(cè)值和真實(shí)值(電子舌測(cè)定的豆?jié){甜味數(shù)值)之間的差異,以此來(lái)驗(yàn)證模型的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)進(jìn)行3組平行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 22.0軟件和Origin9.1軟件進(jìn)行分析,通過(guò)單因素方差分析評(píng)估差異的顯著性。以p<0.05作為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大豆蛋白組成及豆?jié){甜度分析

豆?jié){的主要成分是大豆蛋白,大豆蛋白主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成。這兩種類型蛋白質(zhì)組分占總蛋白質(zhì)的70%以上[1],11S為六聚體形式,由通過(guò)二硫鍵連接在一起的酸性亞基組(AS)和堿性亞基組(BS)組成[20]。7S主要成分包括三個(gè)通過(guò)疏水相互作用和氫鍵連接的亞基α′,α和β[1]。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇的30個(gè)不同品種大豆,其蛋白質(zhì)含量、蛋白亞基組成及含量、水溶性蛋白含量及其豆?jié){制品甜度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 36個(gè)品種大豆的蛋白亞基的電泳圖Fig.1 Electrophoresis of protein subunits in 36 soybean varieties

表2 30種不同品種大豆原料蛋白質(zhì)組成及其豆?jié){甜度分析Table 2 Analysis of protein composition and the sweetness value in soymilk produced from 30 soybean varieties

圖1為模型構(gòu)建組及驗(yàn)證組共36個(gè)大豆品種的蛋白亞基圖譜,由圖1可知,不同品種大豆原料的蛋白亞基組成種類基本相同,而相同蛋白亞基的組成含量卻存在很大差異,不同的貯藏蛋白組成將會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白具有不同的功能特性。

表2則顯示了模型構(gòu)建組中30個(gè)大豆原料蛋白質(zhì)及其亞基的含量組成,以及采用這30種大豆原料所制備的豆?jié){甜度。從表2中可以看出,本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇的30種大豆品種,其蛋白質(zhì)含量,11S、7S含量及亞基組成、11S/7S比例之間存在著廣泛變異。除了水溶性蛋白含量之間差異不顯著(變異系數(shù)6.87%),其余指標(biāo)的變異系數(shù)均大于10%,表明本實(shí)驗(yàn)所選取的實(shí)驗(yàn)品種之間具有豐富的遺傳多樣性。不同品種間蛋白質(zhì)組成亞基種類基本相同,而各個(gè)亞基之間含量差異較大,尤其是7S中的α′、α、β亞基,變異系數(shù)均大于25%,這說(shuō)明不同大豆種子中7S亞基的組成差異十分顯著。而7S含量的變異系數(shù)為20.88%,11S含量的變異系數(shù)為10.01%,表明在大豆種子的貯藏蛋白中,11S的穩(wěn)定性高于7S的穩(wěn)定性。這和周宇峰等[21]、黃明偉等[22]關(guān)于大豆品種間蛋白亞基含量差異性的研究結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)不同品種大豆制得的豆?jié){進(jìn)行電子舌分析后發(fā)現(xiàn),不同品種大豆所制備的豆?jié){甜度測(cè)試平均值為6.48,而測(cè)試值從2.60變化到了8.79,變異系數(shù)為25.95%,不同品種大豆在制得豆?jié){的甜度屬性方面存在著明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明,不同品種大豆因?yàn)槠浠瘜W(xué)組分及組分含量不同,從而導(dǎo)致不同品種大豆制作的豆?jié){在甜度指標(biāo)方面上有很大差異。

2.2 不同品種大豆氨基酸組成分析

表3顯示了30種大豆品種的氨基酸組成,可以看出,大豆種子中天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸的含量高于其他種類氨基酸。不同大豆品種間,所有氨基酸種類的變異系數(shù)均大于10%,而絲氨酸、甘氨酸的變異系數(shù)達(dá)到了40%以上,這表明,不同品種大豆種子中氨基酸含量的分布差異較大,絲氨酸、甘氨酸含量的差異最為明顯。

表3 30種不同品種大豆原料氨基酸組成分析Table 3 Analysis of amino acid composition in 30 soybean varieties

2.3 大豆蛋白、氨基酸含量與豆?jié){甜度相關(guān)性分析

豆?jié){甜度值在很大層面上影響著豆?jié){的整體食用品質(zhì),甜味較濃厚的豆?jié){更易于被廣大消費(fèi)者所接受[18]。豆?jié){甜味與大豆蛋白組分、氨基酸組分的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 豆?jié){甜度值與大豆蛋白及氨基酸含量的相關(guān)系數(shù)和回歸系數(shù)Table 4 Correlation coefficient and regression coefficient in soymilk sweetness value with protein and amino acid contents of soybean materials

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了大豆蛋白組分、氨基酸組分共27個(gè)指標(biāo)與豆?jié){甜度的相關(guān)性,其中α亞基含量、11S含量、7S含量、11S/7S比例、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等8個(gè)指標(biāo)與豆?jié){甜度顯著相關(guān)(p<0.05)。在大豆的蛋白組成方面,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大豆蛋白質(zhì)含量、水溶性蛋白含量和豆?jié){甜味間顯著的相關(guān)性(p>0.05),而在蛋白亞基組成層面,α亞基含量(r=-0.460,p=0.011)、7S含量(r=-0.428,p=0.018)與豆?jié){甜度呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),而11S含量(r=0.370,p=0.044)、11S/7S比例(r=0.436,p=0.016)則與豆?jié){的甜度值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.05)。這表明,在大豆的主要貯藏蛋白中,11S含量的增加將更有利于豆?jié){的甜度,這可能是由于11S中含硫氨基酸比較豐富,更有利于豆?jié){的整體甜味,相比于11S含量,7S含量增加則不利于豆?jié){的甜度。在氨基酸組成方面,蘇氨酸(r=0.373,p=0.042)、絲氨酸(r=0.418,p=0.021)與豆?jié){甜味呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(p<0.05),蛋氨酸(r=-0.372,p=0.043)、酪氨酸(r=-0.464,p=0.010)與豆?jié){甜味之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(p<0.05)。

2.4 豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型

2.4.1 豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建 逐步回歸是一種多元線性回歸方法,可以選擇具有最佳擬合度的自變量組合來(lái)進(jìn)行因變量的預(yù)測(cè)[23],首先,逐步回歸過(guò)程定義了整體模型,之后向先前模型中添加或刪除變量。然后通過(guò)臨界p值驗(yàn)證添加或刪除變量的合格性,從而達(dá)到最優(yōu)的預(yù)測(cè)效果。本研究以α亞基、11S總量、7S總量、11S/7S比例、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等8個(gè)與豆?jié){甜度顯著相關(guān)的大豆品質(zhì)指標(biāo)為自變量,以豆?jié){的甜度值為因變量,通過(guò)逐步回歸的方法建立了豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型,如圖2所示。

圖2 豆?jié){甜度值預(yù)測(cè)模型Fig.2 Predictive model of soymilk sweetness value注:圖中樣品編號(hào)與表1相同。

由圖2可知,逐步回歸過(guò)程中對(duì)原本的8個(gè)自變量進(jìn)行了選擇優(yōu)化,分析了每種自變量組合對(duì)豆?jié){甜度的預(yù)測(cè)效果,最終發(fā)現(xiàn)用α亞基、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等五種指標(biāo)建立的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型具有最佳的預(yù)測(cè)效果,其模型的決定系數(shù)R2=0.747。

預(yù)測(cè)方程為:F(甜度預(yù)測(cè)值)=-0.125×α亞基+3.172×蘇氨酸+1.655×絲氨酸-2.894×蛋氨酸-2.097×酪氨酸+9.908

式(1)

從模型的權(quán)重系數(shù)可以看出,在有利于豆?jié){甜度的指標(biāo)中,相較于絲氨酸,蘇氨酸含量對(duì)豆?jié){甜度的影響更加顯著(p<0.05),而在不利于豆?jié){甜度的指標(biāo)中,蛋氨酸比酪氨酸發(fā)揮著更加突出的作用。這與趙靜等[10]有關(guān)豬骨湯中游離氨基酸呈味特性的研究結(jié)果相近,在其研究中指出,蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸對(duì)豬骨湯的甜味有突出貢獻(xiàn),酪氨酸、亮氨酸、蛋氨酸則會(huì)使豬骨湯呈現(xiàn)苦味。而本研究的結(jié)果顯示,絲氨酸和蘇氨酸有利于豆?jié){的甜度值,而酪氨酸和蛋氨酸則不利于豆?jié){的甜度值。整體而言,具有高含量絲氨酸、蘇氨酸以及低含量α亞基、蛋氨酸、酪氨酸的大豆種子將更加適合生產(chǎn)甜味濃郁的豆?jié){。

2.4.2 豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型的精確性,本研究測(cè)定了模型驗(yàn)證組中6個(gè)大豆品種(編號(hào)V1～V6)的甜度值,以及α亞基、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸的含量,并將測(cè)定的5種指標(biāo)數(shù)值帶入公式1,計(jì)算出模型驗(yàn)證組6種樣品的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)值,并將豆?jié){甜度預(yù)測(cè)值與電子舌測(cè)定的甜度值相比較,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 模型驗(yàn)證組中豆?jié){甜度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的誤差分析Table 5 Relative error analysis between actual and predicted values of soymilk sweetness in model verification group

由表5可知,通過(guò)逐步回歸建立的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型,可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)豆?jié){甜度,通過(guò)公式1計(jì)算出模型驗(yàn)證組中6個(gè)樣品的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)值,并與電子舌測(cè)得的豆?jié){實(shí)際甜度值相比較,其相對(duì)誤差均小于10%。其中,V1、V2、V3、V6的相對(duì)誤差均小于5%,6個(gè)驗(yàn)證樣品的平均相對(duì)誤差為4.61%,這些結(jié)果表明了本研究建立的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型對(duì)豆?jié){實(shí)際甜度有良好的預(yù)測(cè)功能,可以作為豆?jié){甜度預(yù)測(cè)的一種有效方法。

3 結(jié)論

本文研究了30種大豆原料蛋白質(zhì),氨基酸組成及其所制作豆?jié){的甜度值。不同大豆品種的各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)和豆?jié){的甜度值均有較大差異。對(duì)于豆?jié){的甜度,11S、11S/7S、絲氨酸、蘇氨酸含量與豆?jié){的甜度呈顯著正相關(guān),α亞基、7S、蛋氨酸、酪氨酸含量與豆?jié){的甜度呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)逐步回歸建立的豆?jié){甜度預(yù)測(cè)模型具有良好的預(yù)測(cè)能力,模型的決定系數(shù)R2=0.747,預(yù)測(cè)結(jié)果的平均相對(duì)誤差為4.61%,該模型可以作為豆?jié){甜度預(yù)測(cè)的一種有效方法。此方法方便快捷,無(wú)需原料加工和儀器分析,便可預(yù)測(cè)未知大豆品種所加工的豆?jié){甜度。因此,該方法可以廣泛應(yīng)用于豆?jié){生產(chǎn),具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。