陳 歡,羅昭標,馮小艷,張 丹

(1.南昌工學(xué)院,江西南昌 330108; 2.江西省煙草公司撫州市公司,江西撫州 344000)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)植物,蟲媒異花授粉樹種,雙子葉植物,為常綠小喬木或灌木,是我國特有的木本食用油料樹種,有兩千多年的栽培和利用歷史,與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物,與烏桕、油桐和核桃并稱為我國四大木本油料植物。

油茶廣泛分布于南方大部分省份的丘陵地區(qū),普通油茶在我國栽培面積最大,此外小果油茶、浙江紅花油茶、騰沖紅花油茶、攸縣油茶、越南油茶等均有種植[1]。從油茶籽中提取的油脂稱為油茶籽油或者茶油。脂肪酸的組成種類是衡量油茶籽油質(zhì)量的重要指標。油茶籽油營養(yǎng)豐富,富含人體必需的微量元素和不飽和脂肪酸,其不飽和脂肪酸含量高達85%以上,其脂肪酸組成和生理活性,都與橄欖油極其相似,被譽為“中國橄欖油”[2]。

本文通過整理分析,總結(jié)了油茶籽油中脂肪酸的種類與含量動態(tài)變化、脂肪酸組成的影響因素、提取方法、分析方法和分子生物學(xué)研究方面的研究現(xiàn)狀,概括了脂肪酸在油茶籽油摻偽鑒別中的應(yīng)用,并展望了油茶籽油脂肪酸研究重點與方向,為油茶籽油脂肪酸進一步研究提供參考。

1 脂肪酸種類與含量動態(tài)變化

油茶籽油中脂肪酸組成主要是油酸,其次硬脂酸、棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸等,隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展,山萮酸、芥酸等含量較少的脂肪酸也被檢出。目前油茶籽油研究發(fā)現(xiàn)的脂肪酸種類[3]見表1。

表1 油茶籽油中脂肪酸種類Table 1 Fatty acids in Camellia oleifera seed oil

在油茶籽整個生長發(fā)育過程中,脂肪酸含量處在動態(tài)變化中。在掛果穩(wěn)定之前,主要是果實的生長發(fā)育,脂肪酸的形成與積累很少,掛果穩(wěn)定至果實成熟這段時期,脂肪酸變化較大。在掛果穩(wěn)定之后,飽和脂肪酸總量不斷降低,不飽和脂肪酸含量不斷升高,說明在種子發(fā)育過程中,不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸之間可能發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化[4]。在油茶籽成熟過程中,油酸相對含量整體呈上升趨勢,亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸含量呈下降趨勢,硬脂酸含量基本保持平衡,在油茶籽成熟前有小幅增長[5],花生酸和花生烯酸分別的在花后46和48周開始合成檢出[4]。

2 油茶籽油中脂肪酸含量影響因素

2.1 品種(品系)

我國已選育出了200多個油茶高產(chǎn)無性系,廣泛種植的就有20多種,不同油茶品種(品系)之間脂肪酸含量差異較大。對普通油茶、浙江紅花油茶和騰沖紅花油茶三個品種茶籽油脂肪酸相對含量分析[7],發(fā)現(xiàn)油酸、亞油酸、亞麻酸3種脂肪酸總量從大至小依次為浙江紅花油茶、普通油茶和騰沖紅花油茶,棕櫚酸、硬脂酸2種脂肪酸總量從大至小依次為騰沖紅花油茶、普通油茶和浙江紅花油茶。

為規(guī)避不同產(chǎn)地對油茶籽油中脂肪酸含量的影響,祝國祥等[6]在貴州省黎平縣東風(fēng)林場油茶物種園采集了樹齡均在30年以上的尖蓮蕊茶、大寶混合種等14個油茶品種對比,飽和脂肪酸含量大于或等于10%的有6個,有8個低于10%,飽和脂肪酸含量最高的是尖蓮蕊茶(15.85%),大寶混合種最低(8.15%);不飽和脂肪酸含量最高的是大寶混合種(91.5%),尖蓮蕊茶最低(83.56%)。將廣寧紅山茶等5個山茶物種引種到湖南株洲中南林業(yè)科技大學(xué)株洲校區(qū)山茶園種植[8],分析其茶籽油脂肪酸相對含量,研究表明棕櫚酸含量廣寧紅山茶最低,溆浦紅山茶的最高;油酸和硬脂酸的含量厚葉紅山茶最低,騰沖紅山茶和廣寧紅山茶最高;亞油酸以厚葉紅山茶最高,廣寧紅山茶最低,僅為最高值的54.58%;亞麻酸在溆浦紅山茶中未被檢出,而其在廣寧紅山茶和宛田紅山茶中含量最高。

根據(jù)上述研究結(jié)果,大寶混合飽和脂肪酸含量僅為尖蓮蕊茶的51.42%[6],亞麻酸在溆浦紅山茶中未檢出,廣寧紅山茶亞油酸相對含量僅為厚葉紅山茶的54.58%[8],說明品種對脂肪酸含量影響確實較大。

2.2 產(chǎn)地與氣候

我國油茶產(chǎn)區(qū)分布在北緯18°28′～34°34′,東經(jīng)100°00′～122°00′的廣闊地域范圍內(nèi),地域跨度大,各地氣候環(huán)境差異大,導(dǎo)致油茶籽油中脂肪酸的含量不一。通過對我國油茶主產(chǎn)區(qū)浙江、江西、河南、福建和貴州34個點的普通油茶的油茶籽油脂肪酸含量分析,得出油茶籽的粗脂肪含量與產(chǎn)區(qū)緯度和經(jīng)度均呈顯著負相關(guān),油茶籽油的硬脂酸含量與產(chǎn)區(qū)緯度呈顯著負相關(guān),棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸與緯度呈正相關(guān),棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸含量與經(jīng)度呈正相關(guān),油酸、亞麻酸、花生酸與經(jīng)度呈負相關(guān)[9],而劉琦等[10]發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸總量、亞麻酸、油酸的含量隨緯度的降低而升高,而亞油酸的含量隨緯度的降低出現(xiàn)先降后升的趨勢。

對浙江等7個省油茶籽油中脂肪酸分析發(fā)現(xiàn),云南騰沖和江西上饒的山茶籽油的油酸含量相對較低,分別為73.7%和77.7%,其他山茶籽油油酸均在79%以上,其中油酸含量超過80%的產(chǎn)地有浙江衢州與麗水、江西德興、河南信陽、云南楚雄、湖南衡陽、廣西桂林;而油酸含量以產(chǎn)地浙江麗水的最高,高達83.7%;亞油酸的含量在7.9%～9.0%之間,云南騰沖13.6%例外[11]。該研究同時提出可將亞油酸和油酸含量作為鑒別油茶籽油產(chǎn)地的一個重要參考指標。

由此可見,隨著經(jīng)緯度的變化,油茶產(chǎn)地的溫濕度、光照強度與時間、土壤肥力、雨水條件等因素隨著變化,不同脂肪酸的變化趨勢并不一致,但是總脂肪含量與經(jīng)緯度之間呈負相關(guān)關(guān)系,可對此進一步研究,根據(jù)油茶籽油脂肪酸的含量與種類,明確油茶最適經(jīng)緯度,為油茶林發(fā)展提供理論指導(dǎo)。

2.3 采摘時間與方式

在油茶籽成熟期前后,脂肪酸含量處在是動態(tài)變化中,因此不同的采摘時間,得到的油茶籽油脂肪酸含量也不一致。對浙江省油茶籽研究表明,從10月9日到10月19日(11 d),油酸含量從76.8%增加到79.2%僅增加了3.1%,所采油茶籽的油酸含量在10月29日之后達到最大[12]。對信陽油茶9月15日、9月30(標準成熟期)兩次采摘后分析[13],發(fā)現(xiàn)推遲采摘時間,各種脂肪酸含量之和無明顯差異;油酸含量略有升高,亞麻酸、亞油酸比例降低。此外,不同采摘時間的油茶籽油中,油酸含量與亞油酸、棕櫚酸含量呈極顯著負相關(guān)。對比人工采收和自然落果[14],自然落果采收方式的茶籽油酸含量平均值為82.03%,較人工采收方式提高了1.02%。

油茶籽成熟的過程中,油茶籽內(nèi)脂肪酸含量不斷合成積累,會達峰值,但脂肪酸含量峰值的具體時間、油茶籽外觀特征有待研究,隨著這方面研究的深入,可對油茶籽人工采收時間節(jié)點進一步指導(dǎo),在平衡油茶籽成熟度、脂肪酸含量等指標的情況下,明確人工采摘的最佳時間。

2.4 制油工藝

油茶籽油生產(chǎn)上的制油工藝有熱榨法、冷榨法、溶劑浸提法、水代法、水酶法、超臨界CO2萃取法(SCFE)、微波萃取法、亞臨界萃取法(SWE)和超聲波萃取法等方法[15]。

對比SCFE、低溫壓榨、普通螺旋榨三種制油工藝,在棕櫚烯酸和花生烯酸含量上,SCFE比低溫壓榨更優(yōu),說明SCFE可以將油茶籽油中的營養(yǎng)保健成分提取得更為充分,但油酸含量中,SCFE與普通螺旋榨相當(dāng),低溫壓榨優(yōu)于二者,均高出2.8個百分點[16]。張智敏等[17]對比了冷榨法、熱榨法、浸提法、水酶法、SCFE、SWE六種提取方法,表明油酸含量最高的是水酶法毛油79.12%±0.12%,其次是冷榨毛油78.41%±0.10%;亞麻酸含量最高的是冷榨毛油0.57%±0.01%,其次是水酶法毛油和SWE毛油(0.47%),含量最低的是浸出毛油(0.38%);亞油酸含量最高的是熱榨毛油(13.66%±0.14%),其次是SCFE毛油8.88%±0.15%;花生一烯酸含量最高的是水酶法毛油0.84%±0.01%,含量最低的是SCFE毛油0.48%±0.03%?？傮w而言,冷榨毛油的不飽和脂肪酸含量最高87.92%±0.06%,其次是水酶法工藝87.83%±0.05%。

另外據(jù)唐偉卓等[18]研究,油茶不同部位的脂肪酸含量不一致,油茶種仁及餅粕中亞油酸和油酸含量較高,而果殼中硬脂酸和棕櫚酸含量要高于其他部位?？梢娪筒璧钠贩N、部位、產(chǎn)地、經(jīng)緯度、采摘時間、采摘方式和制油工藝都會對油茶籽油中脂肪酸的種類及含量產(chǎn)生影響。

3 油茶籽油中脂肪酸的提取方法與分析檢測

3.1 提取方法

脂肪酸的提取方法可采用油茶籽油生產(chǎn)上的制油工藝,也可采用實驗室的提取方法,如水蒸氣蒸餾法、索氏提取法、回流法、閃式提取法等。王湘南等[22]利用索氏提取法提取分析了44個油茶優(yōu)良品系種子脂肪酸組成,靳高中等[23]利用索氏提取法研究了騰沖紅花油茶3個人工和種群3個天然種群的脂肪酸差異。劉錫葵等[24]利用超聲提取法對比了云南白花油茶籽和紅花油茶籽脂肪酸含量。

對比回流法、浸提法、超臨界萃取法、超聲提取法、閃式提取法5種提取方法,回流法、超聲提取法和浸提法操作時間較長[18],一般需要以小時計算,而閃式提取法在常溫下進行,一次提取操作只需5 min就可以大致達到其他4種方法的提取效果,提取時間短,工作效率高。索氏提取法、水蒸氣蒸餾法需要使用有機試劑,缺點是提取時間長、效率低、試劑消耗量大等。超臨界萃取工藝相對簡單、成分破壞少、效率高、無溶劑污染,但有設(shè)備成本高、維護費用貴等缺點。閃式提取效率高、有機溶劑消耗少、安全環(huán)保等特點,但屬于新型提取技術(shù),在國內(nèi)使用較少。

3.2 分析檢測

3.2.1 定性定量分析 目前,對于油茶籽油的檢測分析主要利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS),首先將脂肪酸制備成脂肪酸甲酯,再用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀根據(jù)各脂肪酸甲酯標準品的出峰時間比對油茶籽油樣品中的色譜峰對各脂肪酸組分定性分析,而各脂肪酸組分的相對含量則是利用色譜峰面積歸一化法計算出。張海鳳[25]先用氫氧化鉀-甲醇溶液將油茶籽油甲酯化,選用石英毛細管色譜柱,氦氣為載氣,程序升溫,質(zhì)譜全掃描方式,共檢出4種脂肪酸,分別為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸,并利用色譜峰面積歸一化法得出這四種組分的相對含量分別為:84.16%,3.65%,10.78%和1.41%。郭華等[26]為檢測24個茶樹品種的茶籽選的脂肪酸,先用甲醇鈉甲醇溶液將油茶籽油甲酯化,用石英毛細管色譜柱,氫氣為載氣,程序升溫,結(jié)果顯示,茶籽油中主要含有20種脂肪酸,其中單不飽和脂肪酸的平均含量為51.06%,主要為油酸;多不飽和脂肪酸平均含量為27.86%,主要為亞油酸;飽和脂肪酸平均含量為20.67%,主要為棕櫚酸和硬脂酸。劉歡等[1]選用安捷倫氣相色譜儀,HP-2NNOWax毛細管柱,氮氣為載氣,分析大果油茶籽油脂肪酸組成,得到14種脂肪酸;艾芳芳等[27]采用氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化,利用DB-23石英毛細管柱,對比離子檢測(SIM)方式與全掃描(SCAN)方式,SIM方式共檢測到油茶籽油中的19種脂肪酸,而全掃描方式僅檢測到7種脂肪酸,且其噪聲遠大于離子檢測方式。因此離子檢測方式大大提高了脂肪酸成分的檢測靈敏度,結(jié)合脂肪酸甲酯混標和 ECL 脂肪酸庫能對更多的脂肪酸成分定性。

油茶籽油中脂肪酸測定需要先甲酯化,一般利用氫氧化鉀-甲醇溶液、甲醇鈉-甲醇溶液進行甲酯化,也有用氫氧化鈉-甲醇溶液的[28],采用氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化的油酸峰面積響應(yīng)更大。氣相色譜柱填充柱和毛細管柱兩種,但在油茶籽油脂肪酸檢測分析中主要采用毛細管色譜柱,離子檢測方式比全掃描方式靈敏度更高。

3.2.2 摻偽鑒定分析 油茶籽油摻偽鑒別方法主要有顯色法[29]、色譜法[30-32]、近紅外光譜法[33-35]、電子鼻技術(shù)[36]等,但是每種方法都有其局限性。脂肪酸作為油茶籽油的標志性物質(zhì),與其他油脂的脂肪酸種類及含量均不同,摻假后會發(fā)生相應(yīng)的變化,因此,利用GC-MS技術(shù)獲得油茶籽油脂肪酸組成,利用摻假油茶籽油樣品中脂肪酸的變化情況對油茶籽油摻假鑒別成為研究的方向。

唐芳[37]利用GC-MS分析了油茶籽油、菜籽油等7種油脂脂肪酸,借助平均矢量法、圖譜法建立了指紋圖譜,利用相似度分析和直觀比較分析可定性地鑒別油脂摻假。彭思敏[38]通過設(shè)計油茶籽油的不同摻假模式(摻偽單一、兩種及多種植物油脂),分析混合的油脂脂肪酸的組成和含量,利用顯著性和相關(guān)性分析建立了基于脂肪酸組成變化的油茶籽油摻偽判別方法,并得到6個油茶籽油摻偽模型的回歸方程。張東生等[39]以油茶籽油脂肪酸組成(氣相色譜分析)為基礎(chǔ),采用化學(xué)計量學(xué)、主成分法、偏最小二乘判別因子分析法來鑒別油茶籽油,結(jié)果表明三者都能將油茶籽油與大豆油、橄欖油、葵花籽油、花生油、菜籽油、棉籽油、玉米油區(qū)分開,偏最小二乘回歸分析法能夠定量預(yù)測分析的摻偽比例為5%～60%的摻偽樣品,且相關(guān)系數(shù)均能達到0.98,通過統(tǒng)計分析方法能夠很好的鑒定油茶籽油摻偽。綜上,利用油茶籽油脂肪酸含量鑒別油茶摻偽可借助統(tǒng)計方法建立圖譜、回歸模型等,進行比對或者統(tǒng)計預(yù)測。

4 脂肪酸分子生物學(xué)研究

現(xiàn)有研究表明,油茶脂肪酸的合成是在質(zhì)體中進行的。首先蔗糖通過糖酵解得到丙酮酸,在脫氫酶的催化下,生成乙酰輔酶A(脂肪酸合成中的底物)。然后乙酰輔酶A通過乙酰輔酶羧化酶的催化生成丙二酸單酰輔酶A,進而在丙二酸單酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)移酶的作用下,丙二酷基與酸基載體蛋白結(jié)合,成為脂肪酸從頭合成的碳源,最后脂肪酸合酶復(fù)合體(FAS)的作用下,發(fā)生連續(xù)的循環(huán)聚合反應(yīng),每次循環(huán)增加兩個碳原子直至合成脂肪酸[40]。

在油茶種子脂肪酸代謝的過程中,涉及到一系列調(diào)控生理生化代謝過程的酶和基因。王建勇[40]對參與飽和脂肪酸合成的裝載酶丙二酰單酰CoA、ACP轉(zhuǎn)酰酶(MCAT),參與長鏈脂肪酸合成的脫水酶-3羥酰CoA脫水酶(HCD),參與脂肪酸β氧化的脂酰CoA脫氫酶(ACAD)、多功能蛋白(MFP)和脂酰CoA硫酯酶(ACOT)以及參與植物抗逆的醛脫氫酶(ALDH)和脂氫過氧化物裂解酶(HPL)進行全長克隆和生物信息學(xué)分析;進行了油茶脂酰CoA脫氫酶基因、醛脫氫酶基因和脂氫過氧化物裂解酶基因3個基因轉(zhuǎn)錄水平的表達研究;催化二酰甘油加上?；舅嵝纬扇８视偷奈ㄒ幌匏倜付８视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)得到克隆和原核融合表達[41];各種脂肪酸從頭合成和油脂合成的限速酶和關(guān)鍵酶異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的4個亞基的cDNA序列已經(jīng)得到克隆,并確定了其在油茶種子中不同組織器官中和不同發(fā)育階段的表達規(guī)律[42];明確使兩個分子的乙酰CoA縮合為乙酰乙酰 CoA的乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因序列特征[43]。脂酰-?；d體蛋白硫酯酶(FAT)核基因編碼的定位于質(zhì)體的球狀蛋白質(zhì),主要功能就是將脂?；?ACP水解成游離脂肪酸和ACP,從而終止脂肪酸從頭合成途徑中脂肪酸鏈的延長,其產(chǎn)物主要是硬脂酸和棕櫚酸,RACE測序結(jié)果表明油茶FatB基因不是一個單基因,而是一個多基因家族[44]。位于脂肪酸合成酶系中央的?；d體蛋白(ACP)是脂肪酸合成中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),其通過催化作用最終生成含十六碳的棕櫚酸[45],而油茶種子脂肪酸代謝的過程中AACT基因、FAD6基因、和SAD基因和油體蛋白基因的分離克隆表達、序列分析和生物信息學(xué)分析均已得到進一步研究[46-49]。

此外,2002年首次建立油茶的cDNA文庫,2004年建立油茶EST文庫,2009年建立油茶種仁轉(zhuǎn)錄組和表達譜數(shù)據(jù)庫,這些成果均說明油茶分子水平的研究已經(jīng)進入轉(zhuǎn)錄組水平,預(yù)示著對油茶的研究已全面的進入了分子生物學(xué)階段。油茶籽的出油率在6%左右,而大豆出油率在20%,花生出油率在48%～56%,可見油茶籽出油率是相當(dāng)?shù)偷?。因?在常規(guī)育種方法提高含油率潛力有限的情況下,分子育種勢必會成為突破口。

5 展望

油茶籽油中富含油酸,可以有效預(yù)防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等[50],其含量多少是評定油茶籽油品質(zhì)的重要標志。亞油酸能防止人體血清膽固醇在血管壁的沉積[51-52],對合成前列腺素、磷脂,維持組織正常功能具有重要作用,我國目前仍采用亞油酸作為防治動脈硬化的藥物[53],另外油茶籽油是油酸生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原料,工藝簡便,產(chǎn)品純度高,利于規(guī)?；a(chǎn),亞油酸可作為催干劑用于油墨、油漆等產(chǎn)品的生產(chǎn),作為增塑劑用于塑料、乳化劑的生產(chǎn)[54]。

油茶籽油中脂肪酸的種類及含量影響因素較多,如油茶的品種、部位、產(chǎn)地、經(jīng)緯度、采摘時間、采摘方式和制油工藝等。脂肪酸的組成種類是衡量質(zhì)量的重要指標,通過油茶脂肪酸的研究,對進一步提升油茶種植技術(shù),明確適宜種植區(qū)域,優(yōu)化油茶籽采摘時間和采摘方式,具有重要參考價值,對油茶產(chǎn)區(qū)農(nóng)民增收、精準扶貧均具有重要意義。特別是隨著《全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2009—2020年)》的落實,這必將進一步加大油茶脂肪酸研究用于指導(dǎo)油茶種植。

通過分析發(fā)現(xiàn),對油茶籽油中脂肪酸的研究很多,多數(shù)集中于脂肪酸含量分析,包括不同品種、不同地域、不同油品等之間的含量分析。隨著生活水平的提高,健康安全用油成為選擇方向,油茶籽油有潛力成為食用油市場的熱銷產(chǎn)品,而摻偽鑒別也將成為其研究重點與熱點,脂肪酸是油茶籽油標志性成分,因此,進一步加強利用脂肪酸組分建立快速、準確的摻偽檢測方法研究,特別是可實現(xiàn)手持式、可商業(yè)化的快速檢測工具與方法亟待研究。

如何提高油茶種子含油率是油茶育種的技術(shù)難關(guān),由于通過常規(guī)育種方法提高含油率潛力非常有限。發(fā)掘油茶種子中的重要基因功能,通過分子育種方法研究參與脂肪酸合成的相關(guān)酶類,掌握油脂和不飽和脂肪酸合成的機理,克隆其關(guān)鍵基因,加大關(guān)鍵基因表達量,從而提高含油率和不飽和脂肪酸比例,是實現(xiàn)品種的改良與優(yōu)化的一種較有潛力的方法。

油茶籽油的關(guān)注點在于其不飽和脂肪酸的高含量。但油茶投資收益慢等缺陷導(dǎo)致油茶籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展受限,因此,油茶脂肪酸相關(guān)分子生物學(xué)研究顯得尤其重要。從分子水平明確茶不飽和脂肪酸的合成機理、酶學(xué)性質(zhì)、調(diào)控基因等,從而將不飽和脂肪酸相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)入花生等生長周期短、繁殖快,單位面積產(chǎn)量高、含油率高的農(nóng)作物或者微生物中進行表達,以達到優(yōu)化相關(guān)油脂不飽和脂肪酸含量的目的。