王婭萍，李敏清，覃琴紅，韋江璇

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530022；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

稽留流產(chǎn)是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔未能及時自然排出者，若不能得到及時診治，會導(dǎo)致母體凝血功能異常、DIC等[1]?；袅鳟a(chǎn)病因復(fù)雜，可能與染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染和免疫因素等[2～5]有關(guān)。母體通過一系列免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答對胚胎產(chǎn)生耐受，母胎的免疫平衡可維持胎兒的正常發(fā)育，這個過程與輔助性T(Th)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞密切相關(guān)[6, 7]。Th17細(xì)胞是一類獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞亞群，可特異性高分泌白細(xì)胞介素(IL-17)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)自身免疫病。Treg細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，與Th17在功能上互相拮抗，可分泌TGF-β使免疫下調(diào)。研究[8]表明，Th17/Treg免疫失衡參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良妊娠的發(fā)生。而在稽留流產(chǎn)患者血清中Treg細(xì)胞比例降低[9]。目前關(guān)于稽留流產(chǎn)患者蛻膜組織Th17細(xì)胞、Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β表達(dá)相關(guān)報道較少。我們觀察了稽留流產(chǎn)患者蛻膜組織Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β的表達(dá)變化，探討Th17/Treg免疫失衡在稽留流產(chǎn)發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月～2018年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院計劃生育門診的30例稽留流產(chǎn)患者作為觀察組，同期30例正常早孕要求行人工流產(chǎn)手術(shù)患者作為對照組，以經(jīng)陰道彩超和人絨毛膜促性腺激素水平動態(tài)監(jiān)測結(jié)果為診斷依據(jù)。兩組孕婦均為單胎自然受孕，既往無不良孕產(chǎn)史，排除子宮及宮頸病變，夫婦雙方染色體正常，排除生殖道感染，排除內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病及自身免疫疾病，男方精液常規(guī)檢查正常。通過末次月經(jīng)推算孕周，超聲測量胚胎的頭臀長以確認(rèn)，兩者相差大于2周者不納入本研究。觀察組年齡22～35(27.43±3.74)歲，孕周6～10(7.57±1.04)周；對照組年齡23～34(27.93±3.32)歲，孕周在6～9(7.70±0.95)周，兩組年齡、孕周間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組均行腹部B超引導(dǎo)行負(fù)壓吸宮術(shù)，將宮腔內(nèi)容物置于0.9%生理鹽水中漂洗干凈，分離出蛻膜組織，保存?zhèn)錂z。本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者及其家屬均已知情同意。

1.2 試劑與儀器 PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4、PE Mouse Anti-Human IL-17A、PE Mouse Anti-Human CD25、647 Mouse Anti-Human FoxP3、Human FoxP3 Buffer Set A+B均購自于美國BD公司，兔抗人IL-17抗體、兔抗人IL-21抗體、兔抗人IL-10抗體、兔抗人TGF-β抗體、S-P超敏試劑盒、DAB顯色液、過氧化氫溶液由福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，低溫高速離心機(jī)、流式細(xì)胞儀由美國Beckman公司生產(chǎn)。

1.3 蛻膜組織Th17、Treg細(xì)胞比例測算 取兩組蛻膜組織Percoll細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。CD4+IL17+Th17 檢測：取淋巴細(xì)胞懸液加入800 μL血清培養(yǎng)基和200 μL 的PMA，37 ℃避光孵育4 h，PBS洗滌重懸后加入4 μL的Hu CD4 PerCP-Cy5.5于4 ℃冰箱避光30 min，250 μL破膜劑破膜后4 ℃避光30 min，加入20 μL的 Hu IL-17A PE MAB，4 ℃避光30 min，PBS洗滌重懸后用流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例。CD4+CD25+Treg 檢測：取淋巴細(xì)胞懸液加入4 μL 的Hu CD4 PerCP-Cy5.5、20 μL 的PE Mouse Anti-Human CD25混勻，避光孵育30 min，加500 μL的 Hu FOXP3 Buffer，避光20 min，PBS洗滌，加20 μL FOXP3-647避光30 min，PBS洗滌重懸后用流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 蛻膜組織IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β檢測 采用免疫組化法。取兩組蛻膜組織取出石蠟切片脫蠟并水化，使用PH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸，熱修復(fù)抗原90 s，3%H2O2室溫孵育15 min，非免疫血清封閉40 min，加一抗(兔抗人IL-17抗體、IL-21抗體、IL-10抗體、TGF-β抗體工作濃度分別為1∶400、1∶300、1∶5 000、1∶400)4 ℃孵育過夜。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min，室溫孵育20分鐘，DAB顯色5 min，自來水充分洗滌；蘇木素復(fù)染1 min，水洗反藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯液透明，中性樹膠封片。免疫組化的染色強(qiáng)度用平均光密度(OD)來表示。在×400光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個視野拍照，使用ImagePro Plus6.0軟件分析計算圖片的OD值，每張切片的OD值為5個視野OD值的平均值，代表相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

觀察組、對照組蛻膜組織Th17細(xì)胞百分比分別為7.21%±1.30%、5.91%±1.06%，Treg細(xì)胞百分比分別為5.75%±1.05%、7.385±1.25%，觀察組、對照組蛻膜組織Th17/Treg分別為1.31±0.41、0.82±0.18,兩組比較，P均<0.05。觀察組、對照組蛻膜組織IL-17相對表達(dá)量分別為0.058±0.007、0.047±0.009，IL- 21相對表達(dá)量分別為0.030±0.009、0.024±0.006，IL-10相對表達(dá)量分別為0.028±0.01)、0.035±0.009，TGF-β相對表達(dá)量分別為0.026±0.007、0.038±0.008，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

免疫學(xué)研究表明，自然妊娠是一種半同種異體移植的過程，母體的蛻膜和胚胎的滋養(yǎng)細(xì)胞共同組成母胎界面，免疫細(xì)胞間的微環(huán)境可維持母胎免疫耐受，對妊娠的正常進(jìn)行起重要作用[4]。以往對免疫平衡的研究[10]集中在Th1/Th2，Th1主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2參與體液免疫應(yīng)答，Th1/Th2是維持正常妊娠的必要條件。近年來有學(xué)者[11]認(rèn)為，Th1/Th2平衡學(xué)說無法全面解釋母胎免疫耐受機(jī)制，遂在此基礎(chǔ)上，提出了Th17/Treg 平衡學(xué)說。

Th17 細(xì)胞是一類獨(dú)特的Th亞群，可分泌IL-17、IL-21等細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在妊娠早期，其表達(dá)下調(diào)[12]。IL-17是Th17的主要效應(yīng)因子，能有效地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的動員興奮過程，從而有效介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)，其與受體結(jié)合后通過MAP 激酶途徑及核轉(zhuǎn)錄因子途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。IL-17作為一種致炎細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，同時又可以促進(jìn)T 細(xì)胞的激活以及產(chǎn)生更多的促炎因子。IL-17在多種自身免疫疾病的組織和血清中異常性高表達(dá)[13]，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜組織IL-17含量較正常早孕患者高[14]。IL-21是Th17產(chǎn)生的另外一種可維持機(jī)體免疫功能的重要細(xì)胞因子，其可能通過抵抗Treg細(xì)胞誘導(dǎo)的母胎免疫保護(hù)作用以及通過對Th17的正反饋調(diào)節(jié)使母胎免疫耐受形成受阻[15]。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，包括Tr1、Th3等。Treg細(xì)胞的特征性標(biāo)志為高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，而后者也是決定其功能的關(guān)鍵基因[16]，可促進(jìn) Tr1分泌高水平的IL-10和中等水平的TGF-β，從而抑制幼稚型和記憶型T細(xì)胞增殖反應(yīng)，防止自身免疫病的發(fā)生，以及促進(jìn)Th3分泌大量TGF-β，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖和分化[17]。孕期母體內(nèi)Treg 細(xì)胞表達(dá)增加，并在母體免疫細(xì)胞到達(dá)胎盤滋養(yǎng)層初次接觸胎兒抗原時起重要免疫保護(hù)作用，當(dāng)Foxp3表達(dá)下降時，可直接影響Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，進(jìn)而降低母體對胎兒的免疫耐受，增加免疫排斥，導(dǎo)致病理妊娠[18]。

以往Th17/Treg平衡在不良妊娠的研究多集中在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)及先兆流產(chǎn)，RSA患者外周血及蛻膜組織中Th17占CD4+T細(xì)胞的比例高于正常早孕患者，同時Treg 細(xì)胞比例降低[19,20]，而稽留流產(chǎn)作為不良妊娠的一種特殊類型，其外周血Treg 細(xì)胞比例較正常早孕患者低[10]。在本研究中，觀察組患者蛻膜組織中Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值、Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-21的表達(dá)量均高于正常早孕人流患者，同時Treg細(xì)胞比例、IL-10和TGF-β的表達(dá)量均低于對照組。這說明在稽留流產(chǎn)的發(fā)病過程中，具有促炎作用的Th17 細(xì)胞發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，上調(diào)IL-17、IL-21表達(dá)，IL-17可誘導(dǎo)炎癥因子聚集于母胎界面[21]，而IL-21又對Th17 細(xì)胞的表達(dá)有促進(jìn)作用，同時具有免疫抑制功能的Treg 細(xì)胞表達(dá)降低，Th17/Treg比例失衡導(dǎo)致母胎界面的免疫排斥反應(yīng)，對胚胎的著床和發(fā)育產(chǎn)生不良影響，促進(jìn)不良妊娠，進(jìn)而導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，在稽留流產(chǎn)患者的蛻膜組織中，Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增加，而Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)降低，Th17/Treg比例失衡在稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但本研究樣本例數(shù)較少，可能存在一定的偏倚，尚需大樣本的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，而Th17/Treg對稽留流產(chǎn)的影響機(jī)制也需更深入的研究。