高培培，張?zhí)m成，朱光輝，盧彬，張數(shù)青

(天津市口腔醫(yī)院，天津300041)

嬰兒血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒常見的良性腫瘤。流行病學(xué)研究[1]表明IH發(fā)病率4．5%～6．5%。在低出生體重兒和早產(chǎn)兒中IH更為常見[2]。IH的病因尚不明確，可能與組織缺氧、高血管生成活性等因素有關(guān)。目前臨床將IH病情分為增殖期(早期快速增殖期、后期緩慢增殖期)和退化期?；純撼錾箅S生長(zhǎng)發(fā)育多數(shù)IH能自然消退，不需要臨床介入治療。但伴發(fā)感染、潰瘍、出血等病情復(fù)雜的IH需要進(jìn)行治療，位于聲門位置的IH可危及患兒生命。近年來，血管瘤的治療理念發(fā)生較大轉(zhuǎn)變，即由消極等待觀察轉(zhuǎn)變?yōu)榉e極干預(yù)的觀察，普萘洛爾、納多洛爾和激光治療等對(duì)IH具有明確療效[3，4]。目前沒有一種治療手段可治愈所有IH患兒，同時(shí)臨床尚缺乏評(píng)估IH病情進(jìn)展的可靠指標(biāo)。研究IH發(fā)生、發(fā)展中的具體分子機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。非編碼RNA可通過影響基因的轉(zhuǎn)錄、RNA的加工修飾、mRNA的穩(wěn)定性及影響染色體結(jié)構(gòu)的裝配等，對(duì)細(xì)胞活動(dòng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理生理學(xué)過程。根據(jù)核苷酸的長(zhǎng)度，非編碼RNA又可分為小ncRNAs(<200 nt)和長(zhǎng)ncRNAs(>200 nt)。微小RNA(micro RNAs, miRNA)是一類由18～25個(gè)核苷酸組成小型內(nèi)源非編碼RNA，miRNA異常表達(dá)能調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管生成、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[5]。miR-130家族的miR-130a位于11q12上，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等過程[6]。B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族包括20種促進(jìn)和抑制凋亡的蛋白，Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白。敲除Bcl-2的小鼠血管內(nèi)皮損傷加重，促進(jìn)血管病變的發(fā)生[7]。目前關(guān)于miR-130a、Bcl-2在IH組織中的表達(dá)相關(guān)報(bào)道較少。本研究選取我院2016年1月～2017年1月間收治的IH患兒臨床病理資料，，觀察IH組織中miR-130a、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2016年1月～2017年1月間收治的IH患兒33例，其中男18例、女15例，年齡1～12月，中位年齡7個(gè)月。所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理診斷為IH。33例患兒均為初次診斷及治療，并排除其他惡性腫瘤，既往未接受激光、藥物注射、手術(shù)等治療。33例患兒均行手術(shù)切除IH，術(shù)中保留IH組織及瘤旁正常皮膚組織。33例份IH組織經(jīng)HE染色后根據(jù)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分期為增殖期(組織血管腔不明顯或血管腔呈裂隙樣，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞核較大且濃染)17例份、退化期(血管腔較多且大，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目較少，且染色較淺，超過20%部位有脂肪浸潤(rùn)或纖維變性)16例份。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，患兒家屬均知情同意并簽字。

1．2 IH、瘤旁正常皮膚組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法。分別取20～30 mg的IH、瘤旁正常皮膚組織，在研缽中加入液氮反復(fù)研磨3次，1．5 mL的EP管中50 mg勻漿中加入1 mL的TRIzol搖勻，加200 μL氯仿混勻后室溫孵育10 min，4 ℃下離心(12 000 rpm，10 min)后形成三層，取上層水樣層。加入等體積異丙醇，離心后取上清液，75%酒精500 μL洗滌后離心棄上清，加入50 μL的DPEC溶解后，-70 ℃冰箱備用。以總RNA為模板，用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(購(gòu)自Takara公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成目的cDNA(反轉(zhuǎn)錄引物oligod(36)AGC)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，-70 ℃保存。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：上下游引物設(shè)計(jì)應(yīng)用primer5．0軟件設(shè)計(jì)。miRNA-130a內(nèi)參選擇U6基因，Bcl-2內(nèi)參基因選擇β-actin。引物均由ABI生物公司合成。miR-130a特異性引物正向序列：5′-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3′，反向引物序列：5′-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3′，內(nèi)參基因U6上游序列:5′-CTCGCTTC-GGCAGCACA-3′，下游序列:3′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-5′，Bcl-2基因上游引物序列：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游引物序列：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′，β-actin基因上游引物序列：5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GGGCATACCCCTCGTAGATG-3′。按照1∶100體積稀釋1 μL的cDNA，加入5 μL的SYBR Green PCR Master Mix、0．4 μL引物。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。均在熒光定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以2-ΔΔCt代表miRNA-130a及Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1．3 IH、瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 蛋白檢測(cè) 采用SP免疫組化染色法。取IH、瘤旁正常皮膚組織標(biāo)本，檢測(cè)各組Bcl-2蛋白，免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟：用切片機(jī)將石蠟包埋標(biāo)本切片(厚度5 μm)，65 ℃烘箱2 h，常規(guī)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度水化后高壓鍋內(nèi)140 ℃、2 min抗原熱修復(fù)，自然冷卻，3% H2O2避光滅活內(nèi)源性過氧化物酶2 min，PBS清洗三次后加入一抗(稀釋比例1∶800)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗三次后，加入二抗(稀釋比例1∶500)，37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木紫復(fù)染3 min，常規(guī)梯度脫水后，樹脂封片照相。Bcl-2陽(yáng)性為內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用圖像分析軟件觀察 IH、瘤旁正常皮膚組織Bcl-2蛋白，每張切片選取5個(gè)視野(×400)，測(cè)算每張切片的平均光密度、陽(yáng)性面積率，陽(yáng)性面積率為計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取5個(gè)視野的平均值。

2 結(jié)果

2.1 IH、瘤旁正常皮膚組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 IH組織、瘤旁正常皮膚組織中miR-130a相對(duì)表達(dá)量分別為3.71±1.23、 0.87±0．21，退化期、增殖期IH組織miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量分別為3.68±1．40 、3．72±1．63；IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.213±0.272 、0．614±0．22，退化期、增殖期IH組織Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較分別為3.68±1．40 、3．72±1．63，與瘤旁正常皮膚組織比較，退化期、增殖期IH組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P均<0.05)。

2.2 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 蛋白光密度值及陽(yáng)性面積率比較 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2光密度值及陽(yáng)性面積率見表1。與瘤旁正常皮膚組織比較，IH組織Bcl-2蛋白光密度值和陽(yáng)性面積率均升高(P均<0.05)；與退化期IH組織、瘤旁正常皮膚組織比較，增殖期IH組織Bcl-2蛋白光密度值和陽(yáng)性面積率均升高(P均<0.05)。

表1 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2光密度值及陽(yáng)性面積率

2.3 IH組織中miRNA-130a與Bcl-2表達(dá)相關(guān)性 IH組織中miR-130a與Bcl-2 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0．451，P=0．008)。

3 討論

IH是嬰兒期最常見的脈管系統(tǒng)腫瘤[8]，女性、早產(chǎn)、低出生體重和多胎妊娠等因素均是發(fā)生IH的危險(xiǎn)因素。IH多發(fā)生于機(jī)體淺表部位，少部分位于內(nèi)臟、肌肉等較深部位，對(duì)于特殊部位的血管瘤，如面部、關(guān)節(jié)、咽喉等處，影響患兒外觀及功能。 IH通常在出生時(shí)不存在，經(jīng)歷瘤細(xì)胞增殖階段，退化階段，并最終隨時(shí)間延長(zhǎng)自行消失。 常見的并發(fā)癥包括破潰、出血、感染及瘢痕形成等，在更嚴(yán)重的情況下，也可導(dǎo)致視力喪失，氣道受損，充血性心力衰竭和死亡。血管瘤傳統(tǒng)的治療方法較多，如手術(shù)、激光、局部注射硬化劑等，但仍有疤痕形成、皮膚色素沉著、血管瘤復(fù)發(fā)等問題。目前血管瘤的病因尚不明確，病理上表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖，合成與分泌功能活躍。近年來，普萘洛爾在治療嬰兒血管瘤中取得良好的療效，具有起效快，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[9]。

miRNA是一類小內(nèi)源性非編碼RNA調(diào)控分子，長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸，其通過直接結(jié)合其靶基因的3′-非翻譯區(qū)(UTR)中的靶位點(diǎn)，可以誘導(dǎo)mRNA降解或充當(dāng)翻譯阻遏物，影響基因表達(dá)，參與正常細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程的調(diào)控，還參與心血管疾病、腫瘤、慢性炎癥及自身免疫性疾病的病理生理學(xué)過程。miR-130家族最初是在調(diào)節(jié)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的研究中發(fā)現(xiàn)，該家族成員包括miR-130a、miR-130b、miR-301a和miR-301b。miR-130在多數(shù)人類癌癥中作為腫瘤促進(jìn)性的miRNA，例如在膀胱癌中miR-130的上調(diào)表達(dá)通過促進(jìn)FAK和Akt磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。研究[11]表明，miR-130a在多種人類惡性腫瘤中異常表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))，包括胃癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌及慢性粒細(xì)胞白血病等。在IH中觀察到miR-130a水平升高，抑制miR-130a表達(dá)后血管瘤細(xì)胞增殖能力與血管形成能力下降[12，13]。本研究中，IH組織中的miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量均顯著高于臨近正常皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果表明miRNA-130a可能與IH的發(fā)生發(fā)展的過程有關(guān)。目前miRNA-130a表達(dá)升高的機(jī)制尚不清楚，可能與抑癌基因的失活，導(dǎo)致miR-130a基因啟動(dòng)子過表達(dá)有關(guān)。miR-130a表達(dá)升高后通過結(jié)合靶基因的3′UTR區(qū)，影響靶基因及下游基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。如其可抑制癌基因CRMP4基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[14]。此外，miRNA-130a可與抑癌基因PTEN相互結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。

血管瘤的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗凋亡系統(tǒng)平衡失調(diào)有關(guān)。Bcl-2家族是參與細(xì)胞凋亡的重要蛋白質(zhì)，包括抗細(xì)胞凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Boo等，以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax、Bak、Bok、Bid等成員。Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白，主要借羧基端的疏水片段連于線粒體膜、胞膜上。BCL-2蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合促凋亡的BCL-2家族成員的BH1，BH2和BH3結(jié)構(gòu)域蛋白形成的疏水口袋，這種相互作用的平衡有助于細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。此外，Bcl-2蛋白可通過影響凋亡過程中內(nèi)源性途經(jīng)中的線粒體釋放細(xì)胞色素C，并影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，影響Ca2+依賴核酸內(nèi)切酶活性，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究中，血管瘤組織中Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于臨近正常皮膚組織中的表達(dá)。表明IH中Bcl-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著增高，與以往報(bào)道[16]一致。其原因可能是Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用抑制正常的細(xì)胞凋亡過程，促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖。此外，本研究結(jié)果表明，增殖期血管瘤組織的Bcl-2蛋白表達(dá)高于退化期。以往研究中亦表明增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平顯著低于退化期的凋亡水平[17]。目前對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡的具體機(jī)制尚不清楚，可能與細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA調(diào)控因子，如miRNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA等，通過影響B(tài)CL-2基因mRNA的表達(dá)有關(guān)。有學(xué)者在動(dòng)脈粥樣硬化研究中發(fā)現(xiàn)，miR-181a能抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[18]。本研究中，血管瘤組織中miR-130a mRNA與Bcl-2mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，結(jié)果表明miR-130a有可能通過上調(diào)Bcl-2mRNA表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡過程的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-130a也可通過上調(diào)Runx3表達(dá)從而間接影響B(tài)cl-2mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增值，影響血管瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IH組織中miR-130a、Bcl-2表達(dá)升高，miR-130a、Bcl-2可能通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡過程，參與IH的發(fā)生發(fā)展。miR-130a、Bcl-2有可能成為新的IH治療靶點(diǎn)和預(yù)后的標(biāo)志物，但其具體作用機(jī)制有待大樣本深入研究。