1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，福建 福州 350101 3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院附屬福建省級機關(guān)醫(yī)院，福建 福州 350003

藍花參[Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A. DC.]為桔?？扑{花參屬的植物，以根或全草入藥，具有益氣健脾，祛痰止咳等功效，臨床上常用于治療感冒、氣管炎、痢疾、百日咳[1]等疾病。藥理學研究顯示：藍花參具有止咳化痰、消炎鎮(zhèn)痛、保肝護胃及其改善胰島素抵抗的藥理作用[2-8]。目前已知藍花參中化學成分包括甾體類、多炔類、揮發(fā)油、苯丙素類、黃酮類及萜類化合物[4,9-16]。其中周向文[4]從藍花參醇提取物中分離出單體化合物，后經(jīng)過波譜學分析并鑒定單體化合物8個，其中五個化合物為黃酮類，包括farobin B、異牡荊素、蘆丁、3′-甲氧基-5,7-二羥基黃酮-6-C-波伊文糖-4′-O-葡糖糖苷和異牡荊素2′′-O-鼠李糖苷。而課題組的前期研究工作則首次采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對藍花參進行分析，初步鑒定了藍花參中的6個化學成分，均為黃酮類，分別是紫云英苷、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜苷[15-16]，說明黃酮類成分為藍花參主要成分之一。鑒于多指標綜合評價藥材質(zhì)量能在一定程度能更全面且準確的對藥材進行質(zhì)量控制，課題組建立HPLC法同時測定藍花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量方案，為藍花參的資源開發(fā)及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 戴安U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)； SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；SB4200DT超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥 藍花參全草干品(批號：14010507，福州回春中藥飲片廠有限公司)經(jīng)福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥學系朱扶蓉副教授鑒定為[Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A.DC.]。蘆丁對照品(批號：100080-201610)、槲皮素對照品(批號：100081-201509)、橙皮苷對照品(批號：110721-201115)購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相乙腈(A)-0.5%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%A；5～10 min，15%～17%A；10～20 min，17%～20%A；20～30 min，20%～20%A；30～40 min，20%～30%A；40～45 min，30%～40%A；45～55 min，40%～60%A；55～60 min，60%～10%A；60～65 min，10%～10%A)；流速：1 mL/min；檢測波長268 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL，見圖1。

2.2 對照品溶液制備 精密稱定蘆丁標準品9.620 mg、橙皮苷標準品10.36 mg、槲皮素標準品10.20 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.9620、1.036、1.020 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取各對照品貯備液適量于同一量瓶中，甲醇稀釋得混合對照品溶液(濃度分別為19.24、41.44、10.20 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 精密稱定藍花參藥材約2.0 g，加入40%乙醇50 mL，精密稱定，超聲30 min，取出，放至室溫，補足重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標準曲線制備 分別精密量取蘆丁、橙皮苷、槲皮素標準品溶液適量，稀釋成一系列各標準品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以各對照品溶液濃度(C)為橫坐標x，峰面積(A)為縱坐標y，得回歸方程。蘆?。簓=0.128x+0.279(r=0.9970)，線性范圍為3.848～48.10 μg/mL；橙皮苷：y=0.101x+0.401(r=0.9965)，線性范圍為4.144～82.88 μg/mL；槲皮素：y=0.097x+0.007(r=0.9990)，線性范圍為1.02～6.12 μg/mL。

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.19%，0.37%，0.50%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0 g，按2.3項下制備供試品溶液，于0、1.5、3，6、9、12 h，按2.1項下色譜條件進樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.61%、0.51%、1.54%，說明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0 g共6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。蘆丁的平均含量為511.418 μg/g，RSD為0.59%；橙皮苷的平均含量為698.209 μg/g，RSD為0.47%；槲皮素的平均含量為118.184 μg/g，RSD為0.76%。說明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同批藍花參藥材6份，每份1.0 g，均精密加入蘆丁、橙皮苷、槲皮素混合對照品溶液適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為99.68%、97.63%、98.71%，RSD分別為1.61%、1.39%、1.45%。說明該方法準確性高,見表1至表3。

表1 蘆丁加樣回收率試驗結(jié)果

表2 橙皮苷加樣回收率試驗結(jié)果

表3 槲皮素加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品測定 精密稱取藍花參2 g，按照上述實驗條件平行測定三份。實驗結(jié)果：蘆丁、橙皮苷、槲皮素含量的平均提取量分別為480.243、780.552、132.469 μg/g，三次驗證試驗的RSD分別為0.81%、0.62%、1.2%。

3 討論

由于乙醇對黃酮類成分的溶解性高[17]，有助于有效成分的提取，故本次實驗采用乙醇作為溶媒對藍花參中的黃酮類成分進行提取。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.03%甲酸水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-0.1%甲酸水均可作為同時測量蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量的流動相。故實驗中考察了上述流動相條件，通過對比發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%乙酸水的色譜峰分離度及峰形相對較好，對洗脫條件進一步優(yōu)化，最終選擇乙腈-0.5%乙酸水梯度洗脫。

課題組前期對藍花參提取條件進行考察，考察內(nèi)容包括乙醇濃度、提取時間和料液比3個參數(shù)，結(jié)果顯示：用40%乙醇在料液比為1∶25的條件下超聲30 min，藍花參中化學成分提取效果最優(yōu)，所以本文對藍花參提取采用該參數(shù)進行供試品溶液制備。

查閱文獻可知，部分中藥材的黃酮類成分具有止咳化痰的作用[18-21]，與藍花參的用法功效不謀而合，課題的前期藥理學研究也說明藍花參在止咳化痰方面具有良好效果[22]，在本次實驗基礎(chǔ)上，下一步擬探討已知化學成分與藥效之間關(guān)系，為闡明藍花參止咳化痰藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定依據(jù)。