劉東升 朱 琳 蘇 蕊 徐繼軍 姚世霞 朱旭江

1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

瀉痢固腸丸(水丸)處方由元代《丹溪心法》卷六中的古湯方加減，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊(cè)》[1]，由人參、白芍、肉豆蔻(煨)等九味藥組成，具有健脾化濕、益氣固腸作用。其中處方中的肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥種仁。具有溫中行氣、澀腸止瀉之功。其主要成分為揮發(fā)油和脂肪油以及一些非揮發(fā)性的活性成分去氫二異丁香酚，具有較強(qiáng)的抑菌作用。2015年版《中國藥典》一部在肉豆蔻單藥材項(xiàng)下收錄了HPLC法測(cè)定去氫二異丁香酚含量的內(nèi)容[2-7]。但瀉痢固腸丸的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有收載相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好的控制該成藥的質(zhì)量，選擇肉豆蔻為研究對(duì)象，采用反相高效液相色譜法對(duì)肉豆蔻中的化學(xué)成分去氫二異丁香酚進(jìn)行含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確為控制肉豆蔻藥材的質(zhì)量提供很好的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；德國Sartorius電子分析天平； KQ-500E數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 材料 去氫二異丁香酚對(duì)照品(批號(hào)：Z09681，上海源葉)；瀉痢固腸丸(A廠、B廠)；甲醇(分析純)；水為超純水。樣品為2017年國抽樣品兩個(gè)廠家14個(gè)批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用試驗(yàn) 色譜柱： Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30)；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；理論塔板數(shù)按去氫二異丁香酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，去氫二異丁香酚與其他成分分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品1.487 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，稱取約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加75%甲醇50 mL，精密稱定，超聲提取30 min(功率500 W，頻率40 Hz)，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取陰性樣品粉末約0.5 g, 照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 在2.1項(xiàng)下色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各25 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照在與對(duì)照品色譜峰相同的保留時(shí)間處無干擾，且基線平穩(wěn)，表明該方法專屬性良好。如圖1所示。

2.3.2 工作曲線與線性范圍 分別精密吸取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25、30、35 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以對(duì)照品溶液的濃度(μL/mL)為縱坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為橫坐標(biāo)(Y)作圖，得到近過原點(diǎn)的一條直線。計(jì)算回歸方程：Y=94.79632X+0.72567，r=0.99996。結(jié)果表明去氫二異丁香酚對(duì)照品在0.3569～6.2454 μL/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，精密量取25 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果峰面積RSD為0.4%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：15081397)25 μL，分別于0、4、8、12、18、24 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)成分峰面積RSD為2.5%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的供試品(批號(hào)：15081397)6份，按本標(biāo)準(zhǔn)擬定的方法平行測(cè)定，并計(jì)算樣品中待測(cè)成分的含量RSD為1.4%(n=6)，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知去氫二異丁香酚含量的供試品(批號(hào)：15081397)6份，按供試品溶液中去氫二異丁香酚含量的100%精密加入去氫二異丁香酚對(duì)照品溶液(濃度為0.004461 mg/mL)10 mL，置具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈?，精密稱取樣品約0.25 g于同一錐形瓶中按供試品溶液的制備方法同法處理，并測(cè)定其待測(cè)成分含量。結(jié)果回收率為101.6%，且RSD小于3.0(n=6)。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 含量測(cè)定 按上述色譜條件對(duì)14批供試品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。A和B兩個(gè)生產(chǎn)廠家的樣品中去氫二異丁香酚含量在0.07～0.32 mg/g之間，數(shù)據(jù)較為分散，可能跟不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝和原藥材質(zhì)量控制有很大關(guān)系。結(jié)合限度規(guī)定發(fā)現(xiàn)只有A生產(chǎn)廠家(批號(hào)：150714)的一批樣品低于限度規(guī)定，可能與生產(chǎn)企業(yè)原藥材的質(zhì)量有關(guān)。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 限度規(guī)定 根據(jù)2015年版《中國藥典》一部肉豆蔻項(xiàng)下規(guī)定按干燥品計(jì)算去氫二異丁香酚(C20H22O4)應(yīng)不得少于0.10%，考慮藥材投入制劑的實(shí)際情況，按處方理論量折算，扣除水分，限度確定為：本品含肉豆蔻以去氫二異丁香酚(C20H22O4)計(jì)，每1 g不得少于0.022 mg。

3.2 提取溶劑的選擇 比較了用甲醇和不同比例的甲醇水溶液(65%、75%和85%甲醇)提取溶劑來提取本品，結(jié)果表明用75%甲醇提取比較充分，且出峰時(shí)間和峰形比較理想。因此選用75%作為提取溶劑。

3.3 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇-水(70∶30)和甲醇-水(60∶40)、甲醇-0.1磷酸(70∶30)、甲醇-乙酸銨(85∶15) 四種流動(dòng)相，結(jié)果表明去氫二異丁香酚在甲醇-水(70∶30)等度洗脫下出峰時(shí)間和峰形理想。因此作為最終的流動(dòng)相。