1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001，2.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 玉林 537001

五味子合劑是柳州市中醫(yī)醫(yī)院的一代老中醫(yī)的驗(yàn)方，由五味子和黃芪等中藥提煉組成。為棕黃色澄明液體，味甜、微酸，具有補(bǔ)氣鎮(zhèn)靜的功效，常用于神經(jīng)衰弱、失眠、健忘、營(yíng)養(yǎng)不良等疾病。其中，五味子在該配方中位列君藥，起主導(dǎo)作用。五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子，具有斂肺止咳、固腎納氣；滋養(yǎng)肝腎、強(qiáng)健筋骨；固精止遺、澀腸止瀉；生津止渴、益氣斂汗；滋腎寧心，調(diào)解酒毒的臨床功效[1-2]。五味子入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，后在《圖經(jīng)本草》和《名醫(yī)別錄》均有記載和考證，具有極高的藥用價(jià)值?，F(xiàn)代研究表明[3-4]五味子具有增加機(jī)體免疫力，清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，升高白細(xì)胞等藥理作用。五味子中所含的木脂素類成分是其主要的有效活性成分，其中以含量較高的五味子醇甲為代表[5-6]，有研究表明[7]五味子醇甲對(duì)急性炎癥小鼠模型和免疫抑制小鼠模型增強(qiáng)效果顯著。鑒于五味子合劑療效確切、應(yīng)用廣泛，口碑較好，而原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，且未見報(bào)道以其有效成分五味子醇甲的含量測(cè)定為定量控制指標(biāo)，對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量控制性不足，因此為了提高五味子合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)五味子合劑中五味子醇甲的含量進(jìn)行初步研究，建立了五味子合劑中五味子醇甲的HPLC含量測(cè)定方法，為評(píng)價(jià)五味子合劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Synergy超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；XS-205Du電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 試藥 五味子合劑(批號(hào)：20170121，柳州中醫(yī)院制劑室制備)。五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)：110857-200304，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，批號(hào)：UN1230，默克股份兩合公司)、乙腈(色譜純，批號(hào)：UN1648，默克股份兩合公司)，冰醋酸(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)：10000218，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯(色譜純，批號(hào)UN1173，默克股份兩合公司)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Ag-ilent EtlipseXDB-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液(60∶40)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，理論塔板數(shù)以五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取五味子醇甲15.97 mg，置25 mL量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(濃度為0.6388 mg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 精密量取五味子合劑10 mL，用乙酸乙酯萃取兩次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例分別稱取除五味子以外的其余藥味，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.3供試品制備方法”制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取上述五味子醇甲對(duì)照品溶液、五味子合劑供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，在上述色譜條件下，供試品中五味子醇甲與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并與相鄰色譜峰分離度大于1.5，陰性無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取上述五味子醇甲對(duì)照品溶液(濃度為0.6388 mg/mL)0.2、0.5、1、2、5 mL定容到10 mL，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定五味子醇甲的峰面積，以五味子醇甲的濃度(x)為橫坐標(biāo)，其峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.426x-0.075，r=0.9993。結(jié)果表明五味子醇甲進(jìn)樣量在0.128～3.194 μg之間與峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取五味子醇甲對(duì)照品溶液(濃度為0.6388 mg·mL-1)10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄五味子醇甲圖譜及峰面積，結(jié)果五味子醇甲平均峰面積值RSD為0.4%。表明該液相色譜儀的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取五味子合劑(批號(hào)為20170121)10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于1、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，記錄圖譜及數(shù)據(jù)并計(jì)算其含量，考察五味子合劑供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：在24 h內(nèi)五味子醇甲平均含量RSD為1.6%。表明五味子合劑供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批五味子合劑6份(批號(hào)為20170121)，分別精密量取10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定五味子醇甲峰面積并計(jì)算其含量，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果五味子醇甲平均含量為0.058 mg/mL，RSD為1.8%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量(含量為0.058 mg/mL)的五味子合劑6份，每份精密量取5 mL，置分液漏斗中，再加入濃度為0.6388 mg/mL的五味子醇甲對(duì)照品溶液0.5 mL，自“用乙酸乙酯萃取兩次”起，按“2.3供試品溶液制備”方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定五味子醇甲峰面積并計(jì)算回收率，平均回收率為97.70%，RSD為1.6%，表明該方法系統(tǒng)誤差較小。結(jié)果見表1。

表1 供試品五味子醇甲回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定 分別取6個(gè)不同批次的五味子合劑各一份，每份精密量取10 mL，按“2.3供試品制備方法”制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定五味子醇甲峰面積并計(jì)算其含量。結(jié)果見表2。

表2 五味子合劑樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

五味子是五味子合劑中的君藥，五味子中有效成分的含量直接影響到藥品的療效。2015年版《中國(guó)藥典》一部將五味子醇甲作為評(píng)價(jià)五味子質(zhì)量的指標(biāo)成分，規(guī)定其含有量不低于0.4%[1]。藥典中含五味子的中成藥中也多采用五味子醇甲含量測(cè)定來(lái)作為質(zhì)量控制指標(biāo)[8-9]。故本實(shí)驗(yàn)以五味子醇甲為質(zhì)量控制指標(biāo)[10]。在對(duì)本品五味子醇甲的分離試驗(yàn)中，考察了甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離不太理想，故改用乙腈-0.5%冰醋酸溶液(60∶40)為流動(dòng)相，目標(biāo)峰五味子醇甲與雜質(zhì)峰分離效果比較理想，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5。在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在218 nm和250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故以250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，與2015版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定一致。該法操作簡(jiǎn)便快捷，重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為控制五味子合劑質(zhì)量的方法。