程蕤，姜輝，周晶，李霽明，汪琛媛

(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，a 藥學部，b 科研科，合肥 230031)

肺動脈高壓(PAH)是由已知或未知原因引起肺動脈壓力異常升高的疾病，最終導致右心心力衰竭甚至死亡，平均生存期僅為2.8年[1]。PAH的治療一直是醫(yī)學界的挑戰(zhàn)，除常規(guī)治療和鈣通道阻滯劑治療外，靶向治療如內皮素受體拮抗劑、前列環(huán)素及其類似物等在動脈型PAH的治療中發(fā)揮了重要的作用[2-3]。

馬西替坦是一種口服的雙重內皮素受體(ETA和ETB)拮抗劑，臨床用于PAH的治療，與已經上市的波生坦相比，馬西替坦有更好的組織分布，與內皮素受體親和性更高，且藥物相互作用少，藥物耐受性和安全性都令人滿意，成為廣受關注的PAH治療新藥物，目前馬西替坦及其片劑在國內尚未上市[4-5]。N,N-二甲基苯胺是合成馬西替坦用的一種原料，鑒于其有一定的毒性，為保證藥品的安全，需要對馬西替坦中N,N-二甲基苯胺含量進行控制。目前，在藥物分析領域常用的色譜法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和色譜聯(lián)用技術[6]，國內對N,N-二甲基苯胺的分析方法還沒有統(tǒng)一標準。已有研究表明，采用氣相色譜法可以定量測定水中的N,N-二甲基苯胺含量[7-9]，采用液相色譜-質譜聯(lián)用可以檢測藥品中痕量N,N-二甲基苯胺的含量[10-11]，而直接用液相色譜分析法來測定N,N-二甲基苯胺的含量，鮮有報道。與氣相色譜法相比，液相色譜法具有定量準確性更好、重復性更好和液相的流動相變化更靈活等優(yōu)點。本組于2014年3月建立了高效液相色譜法測定馬西替坦中的N,N-二甲基苯胺的含量，探討其有效性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國科學儀器公司SSI 500 DETECTOR Dual Wavelength US/Vis，SSI Series Ⅲ 泵，Anastar色譜工作站)；電子分析天平(瑞士梅特勒公司，型號：AB135-S)；紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司，型號：TU1810)；超聲波清洗器(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司，型號：KM-615B)。

1.2 試劑 N,N-二甲基苯胺對照品(北京百靈威科技有限公司，批號：L290N30)；馬西替坦(合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司，批號：1403010、1405010、1405011、1405012)，甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：菲羅門 Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(用磷酸調節(jié)pH值至2.5)-乙腈(20∶80)；流速：1.0 mL/min；檢測波長254 nm，柱溫30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 流動相的選擇 參照文獻[9]“液相色譜法測定水中痕量N,N-二甲基苯胺”中流動相與檢測波長，并在此基礎上，進行流動相篩選及優(yōu)化，確定最終流動相為水(用磷酸調節(jié)pH值至2.5)-乙腈(20∶80)。

2.3 檢測波長的選擇 取N,N-二甲基苯胺適量，精密稱定，用流動相定量稀釋制成每1毫升中約含10 μg的溶液，參照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015年版四部通則0401)，在200～400 nm波長范圍內掃描，見圖1。結果顯示，N,N-二甲基苯胺在254 nm波長處有最大吸收，與參考文獻[9]一致，故選擇254 nm作為檢測波長。

圖1 N,N-二甲基苯胺紫外掃描圖

2.4 溶液的制備

2.4.1 對照品溶液的制備 取N,N-二甲基苯胺對照品適量，精密稱定，用流動相定量稀釋制成1 mL中約含0.5 μg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。見圖2，3。

2.4.2 供試品溶液的制備 取馬西替坦約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋制成每1毫升中含1 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液。見圖4。

圖2 空白溶劑圖

圖3 對照品溶液高效液相色譜圖

圖4 供試品溶液高效液相色譜圖

2.5 線性試驗 取N,N-二甲基苯胺對照品適量，精密稱定，用流動相定量稀釋制成1 mL中約含0.75 mg的溶液，搖勻，精密量取1 mL至50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液0.2、2、3、4、5、6 mL，分別置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下的色譜條件，分別進樣20 μL，記錄色譜圖。以N,N-二甲基苯胺峰面積(A)對濃度(C，μg/mL)進行線性回歸，得回歸方程A=24812C-105.6，相關系數(shù)r=0.9995(n=5)。結果表明，濃度在0.031～0.937 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗 精密量取線性試驗項下濃度為0.625 μg/mL的溶液，按“2.1”項下的色譜條件，重復進樣6次，記錄主峰面積，算得主峰面積的RSD為0.46%，說明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取馬西替坦(批號：1403010)，按“2.4”項下方法配制供試品溶液6份，按“2.1”項下的色譜條件依次測定。結果按外標法計算的平均含量為24.5 ppm，RSD為1.58%。說明本方法重復性好。

2.8 定量限 取線性試驗項下濃度為0.625 μg/mL的溶液，用流動相逐級稀釋成系列濃度的溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，以信噪比S/N=10計算定量限，測得N,N-二甲基苯胺定量限為0.4 ng。

2.9 溶液穩(wěn)定性 按“2.4”項下方法配制供試品溶液，室溫放置，在0、1、2、4、8、12、24h時，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄主峰面積，得主峰面積RSD為0.73%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗 取N,N-二甲基苯胺對照品適量，精密稱定，用流動相稀釋制成每1毫升中含3 μg的溶液，作為對照品貯備液。取馬西替坦(批號：1403010)約20 mg，精密稱定，共9份，分別置20 mL量瓶中，再分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL的上述對照品貯備液，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另按“2.4”項下方法配制對照品溶液。按“2.1”項下的色譜條件測定，按外標法計算回收率。結果N,N-二甲基苯胺的平均回收率為99.58%，RSD為1.22%(n=9)，具體結果見表1。

表1 N,N-二甲基苯胺回收率測定結果

2.11 耐用性試驗 參照中國藥典2015年版四部[12]要求，微調分析條件，按“2.4”項下方法配制供試品溶液，在不同的色譜條件下進樣，以分離度為主要考察指標，考察方法的耐用性，結果柱溫、流速、流動相比例、pH值等進行微小調整，分離度均符合要求，表明本方法的耐用性較好。見表2。

表2 高效液相色譜法耐用性測定結果

2.12 樣品測定及含量限度的確定 按照建立的方法測定3批馬西替坦樣品，按外標法計算N,N-二甲基苯胺含量(批號：1405010為0.0182‰,批號：1405011為0.0211‰，批號：1405012為0.0159‰)。根據(jù)試驗研究結果并參考中國藥典2015年版四部[12]殘留溶劑的相關規(guī)定，同時考慮不同批次間的差異，將馬西替坦中N,N-二甲基苯胺限度規(guī)定為不得過50×10-6。

3 討論

馬西替坦屬孤兒藥，雖然有報道對馬西替坦有關物質進行過測定[13]，但目前關于馬西替坦中N,N-二甲基苯胺含量測定鮮有文獻報道。N,N-二甲基苯胺是合成馬西替坦用的一種試劑，鑒于其有一定的毒性，為保證藥品的安全，通過對馬西替坦中N,N-二甲基苯胺含量測定，可以控制馬西替坦中N,N-二甲基苯胺含量，同時為化學藥品中N,N-二甲基苯胺的含量測定色譜法的選擇提供參考。

筆者曾試圖通過氣相色譜法檢測馬西替坦中N,N-二甲基苯胺含量，但經對色譜柱、載氣及柱溫等條件篩選后發(fā)現(xiàn)在保證N,N-二甲基苯胺與馬西替坦及各雜質達到基線分離的情況下色譜保留時間均大于45 min，檢測效率低。因此，改用液相色譜法，經對檢測波長、流動相組成及比例的優(yōu)化篩選，根據(jù)分離度、柱效及色譜保留時間最終采用水-乙腈體系，以磷酸調節(jié)pH值改善峰形，N,N-二甲基苯胺與馬西替坦及各雜質分離良好，色譜保留時間在20 min內。

國內有很多文獻報道高效液相色譜法適合一些化學藥物有關物質含量檢測[14-16]。本課題采用高效液相色譜法測定馬西替坦中N,N-二甲基苯胺的含量，通過方法學研究，包括線性試驗、精密度試驗、重復性試驗、溶液穩(wěn)定性試驗、回收率試驗以及耐用性試驗等，結果均符合要求，適合馬西替坦中N,N-二甲基苯胺的檢測。