胡永挑，曾小康

（1．浙江省杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院 普通外科，浙江 余杭311121；2．浙江省杭州市第一人民醫(yī)院 ICU，浙江 杭州 310006）

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高、致死率高[1-2]，早期即可經(jīng)淋巴結、血運轉移。近些年隨著飲食習慣、生活習慣和精神壓力的增大，其發(fā)病率有增高和年輕化趨勢[3-5]。直腸癌是威脅中老年人身心健康的重大疾病，給家庭和經(jīng)濟增加了巨大負擔。目前研究已經(jīng)證實免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。腫瘤浸潤性樹突狀細胞（dendritic cells, DC）屬于免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細胞之一，功能最為強大，腫瘤浸潤性樹突狀細胞在腫瘤患者中，可以將腫瘤細胞表面中的分子標志物和代謝產(chǎn)物等腫瘤特異性物質(zhì)傳遞給機體的T細胞，刺激其分化和增殖，如產(chǎn)生細胞毒性T細胞，抑制腫瘤細胞的生長和轉移，但是最近幾年的研究顯示腫瘤浸潤性樹突狀細胞在其他腫瘤組織中表達異常，表現(xiàn)為數(shù)目較少，樹突狀細胞表面分子MHC-II、CD54下降，MHC-II、CD54是樹突狀細胞成熟的標志，其水平降低表明腫瘤組織中樹突狀細胞功能低下，多為不成熟的樹突狀細胞，抗原呈遞能力下降[6-10]。腫瘤浸潤性樹突狀細胞在直腸癌組織中的表達值得研究探討，為此筆者前瞻性收集直腸癌患者50例 及同期直腸良性腫塊50例組織標本，分析比較兩者組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞數(shù)量和表型差異，旨在探討直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞數(shù)量和表型的改變及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性收集杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院2017年1月—2018年6月期間收治的直腸癌組織50例作為觀察組，納入標準：⑴ 直腸癌（直腸癌的診斷依據(jù)為病理診斷）；⑵ 年齡18～65歲；⑶ 同意參與本研究。排除標準：⑴ 感染；⑵ 潰瘍性結腸癌等免疫系統(tǒng)疾??；⑶ 其他惡性腫瘤；⑷ 復發(fā)性直腸癌；⑸ 直腸轉移癌；⑹ 肝腎功能不全；⑺ 心腦肺等重要臟器功能不全。同期收集直腸良性腫塊50例作為對照組 （因良性腫塊行直腸腫塊切除術，取良性腫塊患者正常直腸黏膜組織作為檢測樣本），同時亦無上述重大疾病。兩組年齡、性別、合并癥等差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）。本研究已經(jīng)征得醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 兩組一般資料比較[n（%）]

1.2 觀察指標

⑴ 腫瘤浸潤性樹突狀細胞、樹突狀細胞的MHC-II陽性百分比、樹突狀細胞CD54陽性百分比。⑵ 年齡、性別、合并癥、TNM分期、分化程度、腫瘤最大直徑、淋巴結轉移。

1.3 檢測方法

腫瘤浸潤性樹突狀細胞：行直腸癌切除術，術中取直腸癌組織和良性腫塊患者的正常直腸黏膜組織，直腸癌組織為距離癌灶邊緣1.0 cm以上的直腸癌組織，行免疫組化法[采取鼠抗人單克隆抗體S-100（福州邁新公司），SP法染色]：石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水，孵育，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，抗原修復，滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗，加入工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，顯色劑顯色10 min，沖洗、復染、脫水、透明、封片，400倍鏡下取5個視野，計數(shù)，取值作為該研究對象的腫瘤浸潤性樹突狀細胞數(shù)目。同時取直腸癌組織和良性腫塊患者的正常直腸黏膜組織，利用RPMI1640培養(yǎng)基對組織進行消化，去除血塊、脂肪等組織，剪碎，制作成細胞懸液，250 r/min，離心6 min后棄掉上清液，PBS沖洗，混勻，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。取4 mL細胞懸液，加入淋巴細胞分離液（2 mL，質(zhì)量密度1.077 g/mL），再加入淋巴細胞分離液（2 mL，質(zhì)量密度1.055 g/mL），400 r/min，離心20 min，取位于分離液界面間的細胞。PBS溶液沖洗，250 r/min，離心6 min，2次。置入含10%人AB型血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中（37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜），收集懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為1 × 106個/mL，加入Eppendorf管，100 μL/管，加入4 μL直接標記熒光抗體，置于4 ℃冰箱中避光標記30 min，PBS沖洗2次，利用Beckman coulter公司提供的Epics XL型流式細胞儀檢測組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞MHC-II和CD54陽性百分比。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0完成對本研究的數(shù)據(jù)分析，雙側檢驗下，設置α=0.05為檢驗標準。兩組計量資料、計數(shù)資料分別采用t檢驗、χ2檢驗分析，分別以均值±標準差、百分比的形式呈現(xiàn)。

2 結 果

2.1 不同組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平及表型

與對照組比較，觀察組直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度降低（P=0.002）；MHC-II 陽性DC（%）和CD54陽性DC（%）均降低（P=0.000）和（P=0.000）（表2）。

表2 兩組腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平及表型（±s）

表2 兩組腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平及表型（±s）

類別n腫瘤浸潤性樹突狀 細胞密度MHC-II陽性DC（%）CD54陽性DC（%）觀察組508.17±2.426.65±2.427.49±2.33對照組509.65±2.289.49±2.489.82±2.52 t 3.1485.7954.800 P 0.0020.0000.000

2.2 直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平、表型與臨床病理特征的相關性

與TNM分期為I、II期的患者比較，III的患者腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度降低（P=0.042）；MHC-II陽性DC百分比下降（P=0.000）；CD54陽性DC百分比下降（P=0.023）。中低分化、高分化患者腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度、MHCII陽性DC百分比、CD54陽性DC百分比均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與腫瘤最大直徑＜5 cm者比較，腫瘤最大直徑≥5 cm者腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度降低（P=0.001）；MHC-II陽性DC百分比下降（P=0.000）；CD54陽性DC百分比下降（P=0.023）（表3）（圖1）。

表3 直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平、表型與直腸癌患者臨床病理特征的相關性（±s）

表3 直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞表達水平、表型與直腸癌患者臨床病理特征的相關性（±s）

類別n腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度MHC-II陽性DC（%）CD54陽性DC（%）TNM分期 III207.60±1.735.41±1.826.68±2.02 I、II308.55±1.477.48±1.948.03±1.97 t2.0853.7872.350 P0.0420.0000.023分化程度 中低分化187.92±1.636.43±1.997.11±1.89 高分化328.31±1.826.77±1.927.70±1.87 t0.7540.5931.067 P0.4540.5560.291腫瘤最大直徑（cm） ≥5237.12±1.895.41±1.916.32±2.02 ＜5279.06±2.017.71±1.888.49±1.94 t3.4964.2803.868 P0.0010.0000.000

圖1 不同TNM分期患者CD54和MHC-II表達情況

3 討 論

直腸癌在我國中老年人中較為常見，且由于精神壓力增大等社會因素，其發(fā)病率有上升趨勢，目前已知免疫系統(tǒng)在直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義。本研究探討了直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞數(shù)量和表型改變情況，發(fā)現(xiàn)與良性腫塊比較，直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度、MHC-II陽性DC（%）和CD54陽性DC（%）均降低，且腫瘤直徑越大、TNM分期越高，這種現(xiàn)象越明顯。

樹突狀細胞是加拿大學者Steinman在1937年發(fā)現(xiàn)，由于其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名，在抗原呈遞細胞中功能最為強大，因此在免疫性疾病中一直是研究的一個熱點和重點[11-14]。近些年來，學者們開始重視腫瘤浸潤性樹突狀細胞在腫瘤患者中的作用，正常情況下，腫瘤浸潤性樹突狀細胞可以通過多種途徑達到殺傷腫瘤細胞的作用。首先，腫瘤浸潤性樹突狀細胞可以高表達MHC-I類、MHC-II類分子，可以識別腫瘤相關抗原，動MHC-I類限制性細胞毒性T淋巴細胞反應和MHC-II類限制性的CD4+Thl反應[15]。其次，樹突狀細胞可以增加共刺激分子的表達水平，為T細胞的增殖和活化提供信號[16-17]；另外，樹突狀細胞可以分泌IL-2、IL-12等炎性因子，促進Th1/Th2細胞免疫向Th1免疫漂移，激活、增殖T細胞，生成大量的細胞毒性T細胞；最后，樹突狀細胞可以促進T細胞在腫瘤組織中的聚集，進而誘導IL-12、IFN-γ等抗血管生成物質(zhì)，抑制腫瘤血管形成[18]。但最近有學者[6,19-21]發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性樹突狀細胞在其他腫瘤組織中表達異常，表現(xiàn)為數(shù)目較少，不成熟細胞比例增加，即MHC-II陽性DC百分比、CD54陽性DC百分比下降，導致樹突狀細胞呈遞抗原激活免疫系統(tǒng)的能力下降，最終導致腫瘤患者預后不良。這些結論均與本研究一致，本研究顯示直腸癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞密度、MHC-II陽性DC（%）和CD54陽性DC（%）均降低，且腫瘤直徑越大、TNM分期越高，這種現(xiàn)象越明顯。目前關于腫瘤浸潤性樹突狀細胞在直腸癌組織中的研究尚缺乏，因此本研究具有一定臨床意義，更可靠的理論證據(jù)有待今后更深入的研究佐證。

綜上所述，腫瘤浸潤性樹突狀細胞在直腸癌組織中低表達，不成熟細胞比例增加，與TNM分期和腫瘤直徑有關。