周發(fā)勇

摘 要：為了解肉牛呼吸綜合癥（BRDC）對肉牛的致病性，對肉牛疾病預(yù)防進(jìn)行指導(dǎo)?，F(xiàn)場研究、臨床癥狀和病理變化的分析、病理分離和病原體根據(jù)藥物試驗結(jié)果進(jìn)行分析和處理。從該病例的肺組織中，分離到一種預(yù)防措施和一種蘭科病原體。在PPLO固體生長基團(tuán)上，觀察到典型的“煎蛋狀”的細(xì)菌滴。我們用PCR擴(kuò)增了牛OPF基因的485個靶點。牛前體OPF的基因序列為美國分離株gp45核苷酸序列的98.4%。革蘭氏陰性菌的生物學(xué)特性與內(nèi)臟硫酸菌的生物學(xué)特性相一致。PCR擴(kuò)增16S的rrn基因，擴(kuò)增到14BP。結(jié)果，GenB庫中記錄的賴氏囊藻核苷酸的同源性為99.0%。這些分離物對大鼠有害。對牛的突起高度敏感，對青霉素、西西林、阿米卡星、青霉素、米尼西林敏感。結(jié)果表明，該綜合病原菌是山谷真菌的主體。

某養(yǎng)牛場，從東北的一個牛場進(jìn)口肉牛。疾病在被運(yùn)回后三天就開始了病牛體溫升高，咳嗽、喘息，伴有漿液性流涕、嚴(yán)重呼吸困難等呼吸道癥狀。有些牛還患有血液稀疏。18頭牛在整個病程中死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了解肉牛發(fā)病和死亡的原因，通過田間調(diào)查、臨床癥狀和病理觀察、病原分離鑒定和藥敏試驗，對肉牛發(fā)病和死亡的病原進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，提出了綜合防治措施。

一、材料與方法

1.材料

（1）從死牛的肺和肝組織中分離出無菌材料和實驗動物。同時對肺組織進(jìn)行無菌研磨，充分研磨少量PPLO支原體培養(yǎng)基。樣品冷凍、解凍三次，在-20℃冰箱保存。2013年，廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌實驗室分離鑒定并保存了支原體陽性對照GL-1。從廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買昆明種小鼠18-20g。

（2）試劑和儀器兔血瓊脂平板由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌實驗室制備。PPLO肉湯購自杭州貝斯特生物技術(shù)有限公司，TSA、TSB購自北京路橋科技有限公司，微生物生化反應(yīng)管和藥敏試驗紙購自杭州天河微生物制劑有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增和克隆試劑w從北京康威世紀(jì)生物技術(shù)有限公司采購的低溫臺式離心機(jī)購自貝克曼公司，YY2Ⅲ-8B穩(wěn)定穩(wěn)定電泳儀購自北京61儀器廠;Pro Flex PCR系統(tǒng)購自生命科技公司;721BR09310型凝膠成像系統(tǒng)從Bio-Rad公司購買;孵化器從公司購買。

2.方法

（1）野外調(diào)查，觀察臨床癥狀和病理變化，詢問發(fā)病情況，解剖死牛，肉眼觀察器官形態(tài)。

（2）支原體1.2.2不孕癥的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定：將病牛肺組織切成研磨碗，加入3mL PPLO支原體培養(yǎng)基充分研磨，4000r/min離心10分鐘，丟棄沉淀物，上清液經(jīng)0.45μm過濾。一次性針頭過濾器。濾液以1：10稀釋液接種于PPLO支原體培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-96小時。觀察。如果液體介質(zhì)變色，則將線轉(zhuǎn)移至PPLO固體介質(zhì)。接種后，菌落在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96小時。

（3）細(xì)菌的分離和鑒定：將肺和肝組織制成組織接觸，固定，革蘭氏染色，顯微鏡觀察，取肺和肝組織分別接種在5%兔血瓊脂平板、TSB平板和麥康凱瓊脂平板上，按照俞雄標(biāo)報道的方法進(jìn)行培養(yǎng)。37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱。24-48小時后，觀察細(xì)菌生長，進(jìn)一步取優(yōu)勢菌落。評價。

（4）生物降解特性試驗方法進(jìn)行了細(xì)菌分離的生物測定。該菌株的單個真菌落下，并進(jìn)行生物測定。將0.2毫升單滴接種在微生物化學(xué)試管中，如乳糖、葡萄糖、甘蔗和芥末糖。在尿素等生物測定試管中，應(yīng)用無菌液蠟，37～48小時。觀察到冷卻后的反應(yīng)結(jié)果。

（5）細(xì)菌16SrRNA基因的PCR鑒定

通過接種環(huán)式無菌法，從肺組織分離到一個顯性生長菌落，溶于10μL滅菌ddH 2 O 2。2μL菌液充分搖勻。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系為50ugL：模板2ugL，上下游引物（10ugol/L）2ugL，2x Taq PCR母體混合物25ugL，在50ugL中加入ddH_2O。PCR反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5分鐘，95預(yù)變性60秒，60退火72延伸60秒，共35個反應(yīng)周期，72預(yù)變性10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠水回收后送北京華諾夫時代科技有限公司測序。用BLAST方法分析NCBI的核苷酸同源性。

二、結(jié)果與分析

1.現(xiàn)場調(diào)查、臨床癥狀和病理變化

在引入的58頭小牛中，38頭生病，18頭死亡。在疾病中，預(yù)防和己糖苷的治療是無效的。發(fā)病率和死亡率分別為65.5%和22.4%。病牛體溫高，咳嗽，呼吸困難，流鼻涕。在解剖學(xué)上，這種疾病僅限于肺部和胸部。心臟尖端的葉子、心臟和葉子都有每種紅肉的退化。肺間質(zhì)腫塊增加。這個壞蛋的大小像黃奶酪和白奶酪。氣管支氣管內(nèi)有大量白色牛奶泡沫。箱內(nèi)有少量液體，一袋液體袋和液體黃色。

2.支原體的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)72h開始變色，變色培養(yǎng)基用0.22μm濾針過濾。將濾液接種到PPLO支原體液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明，液體變色時間縮短。液體在24-48h內(nèi)變色時間由紅色變?yōu)楹稚?，培養(yǎng)基顏色均勻、澄清，無渾濁。在PPLO固體培養(yǎng)基上，可以觀察到針尖大小的菌落生長48-96小時。在100x顯微鏡下，所有菜肴均出現(xiàn)典型的“煎蛋狀”菌落。核心更厚，向下生長到中間。在它周圍有一層透明的薄層。根據(jù)菌落形態(tài)特征，初步鑒定為牛支原體。

3.病原菌的分離結(jié)果

有少量的堅韌的革蘭陰性菌在肺組織的組織染色后仍在正常肝組織中不可見。5%兔血瓊脂平板和TEC板提高后，肝組織不分離細(xì)菌，中等大小，圓形，表面在肺組織的提高，濕滑的灰白色菌落。凈化后，他們使用新鮮血液瓊脂平板接種。在相同條件下，孵育24小時。根據(jù)研究結(jié)果，新鮮血液瓊脂證明有沒有黃色，中等大小，無細(xì)菌生長。這種真菌是透明、光滑、無溶血。A在室溫下24小時后，在菌落中心觀察到紅色的色素。TSB組成長24小時渾濁和沉淀管底部的小點點。在蘭蘭染色檢測，純化后的菌株是革蘭陰性菌。

4.株細(xì)菌生化特性的鑒定

根據(jù)生化特性試驗方法進(jìn)行生化鑒定。表明該分離物能分解葡萄糖、蔗糖、不水解尿素等。V-P試驗陽性。該菌的生化特性符合粘質(zhì)沙雷氏菌的基本生化特性。

5.藥物敏感性試驗和治療結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，肉牛機(jī)體對有遠(yuǎn)見的犬毒、阿替西林、新卡尼林敏感，對真菌和青霉素敏感。對多合子細(xì)菌的B-和向下的尼西林VI不敏感。對青霉素、聚石灰B、利福庫敏感。先鋒六號和其他無反應(yīng)物質(zhì)。在家里，用100種毒液對一頭有流淚、咳嗽和稀釋癥狀的肉牛進(jìn)行消毒，并對整頭牛進(jìn)行消毒，收集糞便并進(jìn)行發(fā)酵。它是用5-7天的鸚鵡素和磨碎的半松樹來對抗牛和牛的肌肉注射，并伴有流淚和咳嗽。對有擴(kuò)張癥狀的牛進(jìn)行滴注和強(qiáng)化治療。注射3-5天的肌肉以防止其他肉牛。加強(qiáng)管理，增加多維微量元素，提高抗逆轉(zhuǎn)。八天后所有的牛接受了治療，疾病得到了控制，并且沒有發(fā)現(xiàn)新的疾病例子。

三、結(jié)語

這些樣品沒有進(jìn)行病毒檢測。本實驗室分離的牛支原體和粘質(zhì)沙雷菌對大觀霉素、阿奇霉素、阿米卡星、慶大霉素和新霉素高度敏感。采用大觀霉素和地塞米松聯(lián)合治療該病，取得了良好的效果。最后，控制了疾病的發(fā)生，沒有出現(xiàn)新的病例。由此可見，引起B(yǎng)RDC的病原體是支原體和粘質(zhì)沙雷氏菌的混合感染。

參考文獻(xiàn)：

[1]牛呼吸道疾病綜合征病例的病原分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2015， 42（9）：2481-2486.

[2]陳鳳芝. 牛呼吸道疾病綜合征病例的病原研究[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊， 2017.

[3]曹伯才. 肉牛呼吸道疾病綜合征病理分析與防治[J]. 中國畜禽種業(yè)， 2017， 13（4）：127-127.

[4]徐勛彪. 腎病綜合征患者下呼吸道醫(yī)院感染病原菌分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2010， 20（20）：3176-3176.

[5]劉志鵬， 董秀梅， 師東方， et al. 牛呼吸道疾病綜合征的主要病原[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息， 2012（12）：9-11.