唐婉，尹菁，張圓，石蓓佳，李攀，3，陸益紅，樊夏雷

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，徐州 221004；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210009；3.中國藥科大學(xué)，南京 210009)

仿制藥質(zhì)量差異直接影響藥物安全性和有效性。2017年2月，國務(wù)院正式發(fā)布《“十三五”國家藥品安全規(guī)劃》，將一致性評(píng)價(jià)列入產(chǎn)品質(zhì)量升級(jí)工程，其重要性已經(jīng)上升到國家戰(zhàn)略層面[1]。臨床推廣使用仿制藥的前提，是仿制藥必須與指定的參比制劑藥學(xué)等效(pharmaceutical equivalence，PE)和生物等效(bioequivalence，BE)，以避免仿制過程中的質(zhì)量誤差。仿制藥和原研藥在多種不同pH值溶出介質(zhì)中溶出行為相似性是評(píng)價(jià)固體口服制劑PE的重要組成部分，也是對(duì)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的最主要方法[2-3]。體外溶出曲線的擬合可幫助仿制藥企業(yè)對(duì)處方工藝進(jìn)行篩選與優(yōu)化[4]。GastroPlusTM軟件[5]是一種基于機(jī)制性生理模型的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)(physiologically based pharmaeokineties/pharmacodynanfics，PBPK/PD)模擬軟件，目前已在美國食品藥品管理局(FDA)、國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)以及全球頂尖制藥公司中得到廣泛應(yīng)用，被譽(yù)為同類軟件中的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。萘普生 (naproxen)為苯丙酸類非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床主要用于治療風(fēng)濕性疾病、痛風(fēng)及術(shù)后疼痛等[6]，屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system，BCS)II類(低溶解性、高滲透性)藥物?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版[7]、《英國藥典》(British Pharmacopoeia，BP2017)[8]、《美國藥典》(United States Pharmacopoeia，USP40)[9]及日本橙皮書[10]均有收載。其中2015年版《中華人民共和國藥典》溶出度項(xiàng)下溶出介質(zhì)pH值、溶出裝置、取樣時(shí)間、檢測(cè)波長及限值與日本橙皮書收載方法均有較大差異。筆者對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較，以便進(jìn)一步完善現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。采用GastroPlusTM軟件構(gòu)建萘普生片體內(nèi)外PK模型，結(jié)合體外溶出結(jié)果，對(duì)各仿制藥進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，為開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)提供可以借鑒的思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 自動(dòng)溶出儀(采用針式取樣方式，瑞士SOTAX公司)，UV-2550型紫外檢測(cè)器(日本島津公司)，真空脫氣機(jī)(天大天發(fā)科技有限公司)。

1.2試藥 磷酸二氫鉀(批號(hào)：20171209)、磷酸氫二鈉(批號(hào)：20170306)、冰醋酸(批號(hào)：20180118)、氫氧化鈉(批號(hào)：20160720)以及鹽酸(批號(hào)：20171214)均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；萘普生對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100198-201205，純度：99.9%)。參比制劑萘普生片[日本田邊三菱(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation)公司，批號(hào)：B041A，規(guī)格：0.1 g]；仿制制劑分別為A企業(yè)樣品(批號(hào)：160908)，B企業(yè)樣品(批號(hào)：170301)，C企業(yè)樣品(批號(hào)：160501)，D企業(yè)樣品(批號(hào)：160802)，E企業(yè)樣品(批號(hào)：150108)，F(xiàn)企業(yè)樣品(批號(hào)：160703)，G企業(yè)樣品(批號(hào)：170204)，H企業(yè)樣品(批號(hào)：009150502)。8家國產(chǎn)制劑規(guī)格均為0.1 g。

2 方法與結(jié)果

2.1溶出度測(cè)定方法的選擇

2.1.12015年版《中華人民共和國藥典》與日本橙皮書收載溶出度方法比較 將參比制劑分別按照日本橙皮書 (漿法，轉(zhuǎn)速：50 r·min-1，pH值6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，體積900 mL，檢測(cè)波長272 nm)和2015年版《中華人民共和國藥典》(籃法，轉(zhuǎn)速：100 r·min-1，pH值7.4磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，體積900 mL，檢測(cè)波長331 nm)中的溶出度檢查方法，測(cè)定0，5，10，15，30，45和60 min累積溶出量，以確定更適宜的溶出方法用于本研究，結(jié)果見表1。由表1可知，2015年版《中華人民共和國藥典》溶出條件較劇烈，在5 min時(shí)累積溶出量已達(dá)90.81%。日本橙皮書中收載方法更符合藥物在體內(nèi)釋放過程[11]。將同一溶出樣品分別于272和331 nm波長處測(cè)定吸光度值，計(jì)算溶出量，采用SPSS16版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，兩波長下檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.992，>0.05)。272 nm波長處檢測(cè)時(shí)，需對(duì)樣品進(jìn)行第二步稀釋，該操作可能造成一定誤差，為減少操作誤差、減輕工作負(fù)擔(dān)，本研究推薦331 nm為檢測(cè)波長。

表1 兩種溶出方法累積溶出量測(cè)定結(jié)果

Tab.1Resultsofcumulativedissolutionwithtwodissolutionmethods

%

2.1.2pH值-溶解度曲線的測(cè)定 取過量萘普生原料藥，加入37 ℃溶出介質(zhì)中振蕩過夜，取適量適宜倍數(shù)稀釋，采用HPLC法[7]測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算振蕩過夜后溶液中萘普生含量，推算萘普生在不同pH值溶出介質(zhì)中的溶解度(表2)。一般釋放介質(zhì)的體積為藥物飽和溶液所需介質(zhì)體積的至少3倍量時(shí)認(rèn)為滿足漏槽條件[2]，表2中以3倍計(jì)，根據(jù)飽和所需介質(zhì)體積是否小于釋放介質(zhì)體積900/3=300 mL來判斷是否滿足漏槽條件。

表2結(jié)果顯示，pH值5.5處于漏槽條件的邊緣，隨著pH值增高，萘普生溶解度上升顯著。pH值6.8、pH值7.4溶出介質(zhì)滿足漏槽條件，萘普生在相同pH值緩沖液中，依磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽順序溶解度逐漸增大。

2.1.3溶出曲線測(cè)定方法的確定 根據(jù)“2.1.1”項(xiàng)溶出度方法比較結(jié)果，以及pH值-溶解度曲線測(cè)定結(jié)果，確定溶出曲線測(cè)定方法為漿法，轉(zhuǎn)速50 r·min-1，體積900 mL，檢測(cè)波長331 nm。同時(shí)依據(jù)pH值-溶解度曲線測(cè)定結(jié)果，以及萘普生在體內(nèi)主要吸收部位，選擇以下溶出介質(zhì)[12]：①pH值6.8磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀1.70 g和磷酸氫二鈉1.775 g，用水溶解并稀釋至1000 mL)；②pH值6.0磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液28 mL，加磷酸二氫鉀6.80 g，水溶解并稀釋至1000 mL)；③pH值5.5醋酸鹽緩沖液(2 mol·L-1醋酸溶液3.0 mL，加醋酸鈉5.98 g，水溶解并稀釋至1000 mL)；④pH值1.2鹽酸溶液(鹽酸7.65 mL，加水稀釋至1000 mL)；⑤水。

表2 萘普生原料藥在不同溶出介質(zhì)中的溶解度

Tab.2Solubilityofnaproxenindifferentdissolutionmedia

介質(zhì)溶解度/(mg· mL-1) 飽和所需體積/mL是否符合漏槽條件pH值1.2鹽酸溶液0.02853514否pH值4.0醋酸鹽緩沖液0.04522214否水0.04662146否pH值4.5磷酸鹽緩沖液0.04852062否pH值4.5枸櫞酸緩沖鹽0.06151626否pH值4.5醋酸鹽緩沖液0.1040962否pH值5.0枸櫞酸緩沖鹽0.1270787否pH值5.5磷酸鹽緩沖液0.2890346否pH值5.5枸櫞酸緩沖鹽0.3150318否pH值5.5醋酸鹽緩沖液0.4000250是pH值6.8磷酸鹽緩沖液2.720037是pH值7.4磷酸鹽緩沖液5.120020是

2.2溶出度測(cè)定方法的驗(yàn)證

2.2.1穩(wěn)定性考察 取萘普生原料藥，置溶出杯中，在上述溶出度測(cè)定條件下，分別加入上述5種溶出介質(zhì)(37 ℃)，于30，45，60，90，120，240 min取樣測(cè)定331 nm波長處吸光度，結(jié)果表明萘普生在240 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2線性關(guān)系考察 取萘普生原料藥105.66 mg，精密稱定，置100 mL量瓶，用pH值6.8溶出介質(zhì)溶解并定容，精密吸取適量，用溶出介質(zhì)稀釋，得21.13，42.26，63.40，84.53，105.66，126.79，149.50 μg·mL-1系列溶液，測(cè)定波長331 nm處各濃度溶液的吸光度值，分別為0.1468，0.2904，0.4352，0.5821，0.7165，0.8625，1.0218。線性方程為：Y=0.0068X+0.0037，r2=0.9999。

2.2.3回收率實(shí)驗(yàn) 取相當(dāng)于萘普生片1片的輔料，按比例精密稱定，置100 mL量瓶，分別加入適量萘普生對(duì)照品，用pH值6.8溶出介質(zhì)溶解并定容，精密吸取適量，用溶出介質(zhì)稀釋，制成相當(dāng)于濃度水平為80%，100%，120%的溶液，測(cè)定波長331 nm處吸光度，計(jì)算回收率?；厥章?%)=測(cè)得量/稱樣量×100%。結(jié)果見表3，平均回收率99.46%，RSD=0.41%。

2.3溶出曲線的繪制 對(duì)8種仿制制劑和參比制劑各取1批，按“2.1.3”項(xiàng)確定的溶出介質(zhì)和方法進(jìn)行溶出曲線的繪制。pH值5.5、pH值6.0、pH值6.8介質(zhì)在5，10，15，30，45，60 min時(shí)取樣，pH值1.2介質(zhì)與水中取樣點(diǎn)分別延長至120和240 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣10 mL，及時(shí)補(bǔ)液10 mL，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)累積溶出量，結(jié)果見圖1。

表3 pH值6.8溶出介質(zhì)中萘普生片回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.3ResultsofrecoverytestsonnaproxentabletsindissolutionmediaatpH6.8

n=9

結(jié)果表明，參比制劑和仿制制劑在pH值1.2溶出介質(zhì)和水中盡管均溶出不完全，但溶出速率、累積溶出量仍存在較大差異。參比制劑在pH值5.5、pH值6.0、pH值6.8溶出介質(zhì)中，10 min時(shí)平均溶出率均>85%；8種仿制制劑在pH值5.5、pH值6.0溶出介質(zhì)中，10 min時(shí)平均累積溶出量均<85%；在pH值6.8溶出介質(zhì)中，僅C廠家制劑在10 min時(shí)平均累積溶出量>85%。綜合以上結(jié)果，8種仿制萘普生片在5種溶出介質(zhì)中與參比制劑的累積溶出量均存在較大差異。

2.4溶出曲線相似性評(píng)價(jià) 采用FDA推薦的相似因子(f2)法，分別對(duì)pH值6.8、pH值6.0、pH值5.5溶出介質(zhì)中仿制制劑與參比制劑的溶出曲線進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)。f2計(jì)算公式如下[13]：f2=50*lg { [1+1/n*∑(Rt-Tt)2]-1/2*100}

其中，n為溶出度試驗(yàn)取樣點(diǎn)個(gè)數(shù)；Rt與Tt分別為參比制劑與仿制制劑t時(shí)間平均累積溶出量(%)。當(dāng)兩條曲線f2值>50時(shí)，可認(rèn)為溶出曲線相似，且值越大相似度越高。結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，在pH值5.5、pH值6.0溶出介質(zhì)中8種仿制萘普生片與參比制劑溶出曲線相似因子f2值均<50；在pH值6.8溶出介質(zhì)中僅有C廠家生產(chǎn)的萘普生片f2值>50。即國內(nèi)8種萘普生片體外溶出曲線與參比制劑基本不一致。

A.pH值6.8緩沖液；B.pH值6.0緩沖液；C.pH值5.5緩沖液；D.pH值1.2溶液；E.水

表4 不同溶出介質(zhì)中萘普生片溶出曲線相似性分析結(jié)果(f2值)

Tab.4Similarityanalysisofdissolutionofnaproxentabletsindifferentmedia(f2)

廠家pH值6.8pH值6.0pH值5.5A25.616.816.3B30.618.614.3C58.743.139.2D23.215.113.9E31.619.417.7F39.324.121.9G26.013.411.7H33.621.225.4

2.5GastroPlusTM軟件建立萘普生片體內(nèi)外相關(guān)性模擬的研究 收集文獻(xiàn)報(bào)道的不同給藥途徑、給藥劑量的藥動(dòng)學(xué)曲線，以及GastroPlusTM軟件基于萘普生化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的理化參數(shù)。主要參數(shù)有：logP[14]為3.18，pKa[14]為4.15，溶解度(pH值3.96)為0.0649 mg·mL-1，擴(kuò)散系數(shù)為0.87×105cm2·s-1，粒子密度為1.2 g·mL-1，滲透性為1.461×104cm·s-1，半衰期為12.8 h，血漿清除率為1.249 16 L·h-1，表觀分布容積為0.048 94 L·kg-1。

2.5.1萘普生驗(yàn)證性PK模型的構(gòu)建 在軟件吸收和處置模型中加載相應(yīng)理化參數(shù)和靜脈注射藥-時(shí)曲線數(shù)據(jù)[15]，模擬藥物體內(nèi)消除過程，對(duì)比預(yù)測(cè)值與文獻(xiàn)收載實(shí)測(cè)值差異，評(píng)估模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，通常模型預(yù)測(cè)的Cmax和AUC值與實(shí)際值誤差≤2倍、擬合度>0.7即可證明建立的模型較準(zhǔn)確[16]，擬合度 (R2)越高，模型預(yù)測(cè)越準(zhǔn)確。結(jié)果見圖2。

圖2顯示，預(yù)測(cè)曲線與實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)點(diǎn)基本重合，PK模型R2達(dá)0.976；表明初步建立的PK模型能夠較好地反映萘普生給藥后在人體內(nèi)的清除和分布特征。

圖2 靜脈給藥PK曲線模擬(曲線)與實(shí)測(cè)結(jié)果(方格)

Fig.2SimulativePKmodel(line)andclinicaldata(squares)ofintravenousadministration

2.5.2口服萘普生500 mg的PK模型驗(yàn)證 由于口服藥物在人體胃腸道存在溶出和吸收過程，且處置過程較靜脈給藥復(fù)雜，故用文獻(xiàn)收載的萘普生片實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)[17]對(duì)GastroPlus軟件預(yù)測(cè)理化參數(shù)和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估GastroPlus軟件模型對(duì)口服萘普生給藥后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性(圖3)。模型預(yù)測(cè)參數(shù)與實(shí)測(cè)參數(shù)基本吻合，R2達(dá)0.980，表明模型溶解、溶出過程的公式以及所應(yīng)用的相關(guān)參數(shù)較合理地描述了萘普生相應(yīng)特征，建立的PK模型可行。

圖3 口服萘普生片500 mg PK曲線模擬(曲線)與實(shí)測(cè)結(jié)果(方格)

Fig.3SimulativePKmodel(line)andclinicaldata(squares)oforaladministrationofnaproxenat500mg

2.5.2以pH值6.8為溶出條件預(yù)測(cè)體內(nèi)PK曲線 在已驗(yàn)證的模型基礎(chǔ)上，將參比制劑及8家萘普生片仿制制劑在pH值6.8溶出介質(zhì)下的體外溶出數(shù)據(jù)加載到GastroPlusTM軟件，將Dissolution Model設(shè)置為Z-factor，軟件通過體外溶出曲線計(jì)算萘普生Z-factor值，并將溶出曲線轉(zhuǎn)換成體內(nèi)PK曲線，同實(shí)測(cè)的體內(nèi)藥時(shí)曲線進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖4。

結(jié)果表明，除參比制劑外，8家萘普生片仿制制劑的PK模擬曲線同實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)均存在較大差異，說明8種萘普生片仿制制劑與參比制劑體內(nèi)過程基本不一致。

2.5.3模擬PK參數(shù)比較 結(jié)合溶出曲線等信息，利用所建立的PK模型，對(duì)不同企業(yè)樣品以及參比制劑的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，計(jì)算與文獻(xiàn)實(shí)測(cè)曲線的擬合度。

結(jié)果表明，除參比制劑所得參數(shù)同文獻(xiàn)參數(shù)基本一致，R2為0.979。8家仿制制劑Cmax、tmax同文獻(xiàn)記載參數(shù)均存在較大差異，R2均低于0.7。故8家仿制萘普生片與參比制劑PE和BE基本不一致。

3 討論

萘普生片的原研制劑為FDA認(rèn)可的0.5 g規(guī)格的“Naprosyn”(ATHNAHS PHARMA US LTD)，但目前已停產(chǎn)。日本橙皮書公布的萘普生參比制劑為MITSUBISHI Tanabe Pharmaceutical Co.Ltd.(田邊三菱公司)“NAIXIN”0.1 g 規(guī)格，且與國內(nèi)多數(shù)仿制制劑規(guī)格相同，故本研究采用其為參比制劑。目前，已發(fā)表的文獻(xiàn)中，考察萘普生在多種溶出介質(zhì)中的溶出行為的研究筆者較少見到，且尚未見探究萘普生片體內(nèi)外相關(guān)性的報(bào)道，故本研究可為我國仿制藥質(zhì)量的提升及質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)提供可以借鑒的思路。

本研究中，由于參比制劑與8家仿制制劑在pH值1.2和水兩種溶出介質(zhì)中溶出率較低，因此僅對(duì)pH值6.8、pH值6.0、pH值5.5三種溶出介質(zhì)中萘普生片的溶出度數(shù)據(jù)進(jìn)行f2計(jì)算。由體外溶出曲線可看出，與參比制劑相比，8種仿制制劑溶出速率均較慢，溶出過程中崩散也較慢，故推測(cè)其不一致可能由輔料差異和壓片工藝造成。

因無法獲得參比制劑的體內(nèi)實(shí)測(cè)數(shù)值，故將參比制劑和8家仿制制劑體外溶出數(shù)據(jù)在已驗(yàn)證模型基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)的體內(nèi)參數(shù)同文獻(xiàn)實(shí)測(cè)參數(shù)[16]進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)參比制劑所得參數(shù)同文獻(xiàn)報(bào)道參數(shù)基本一致，而8家仿制制劑所得參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的存在一定差異，主要表現(xiàn)為Cmax較低，而Tmax較大，考慮是由于輔料的差異導(dǎo)致藥物延遲時(shí)間存在差異，故影響體內(nèi)藥物的吸收速度和程度。

剖析各家制劑處方工藝，由于萘普生為難溶性藥物，參比制劑選用了聚維酮改進(jìn)活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient，API)的溶出度，而仿制制劑處方中大多未見增溶輔料。結(jié)合一致性評(píng)價(jià)結(jié)果，仿制制劑處方工藝有必要進(jìn)一步優(yōu)化，以達(dá)到質(zhì)量和療效與參比制劑一致。

通過GastroPlusTM軟件建立萘普生片的吸收和處置模型，建立仿制藥和原研藥體外溶出曲線與體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)曲線之間的相關(guān)性模型是一致性評(píng)價(jià)工作一種有益的嘗試。若藥物的體外溶出與體內(nèi)吸收之間能建立良好的相關(guān)性，則可通過體外溶出數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)吸收過程，從而減少BE試驗(yàn)帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并且縮短藥物的研發(fā)周期，降低制劑生物不等效風(fēng)險(xiǎn)。

A.A企業(yè)樣品；B.B企業(yè)樣品；C.C企業(yè)樣品；D.D企業(yè)樣品；E.E企業(yè)樣品；F.F企業(yè)樣品；G.G企業(yè)樣品；H.H企業(yè)樣品；I.參比制劑

圖4 參比制劑與8種國產(chǎn)萘普生片PK曲線模擬(曲線)與實(shí)測(cè)結(jié)果

A.sample A；B.sample B；C.sample C；D.sample D；E.sample E；F.sample F；G.sample G；H.sample H；I.reference

Fig.4SimulativePKmodel(line)andclinicaldete(squares)ofreferencelisteddruganddomesticnaproxentabletsfromeightcompanies

表5 參比制劑與8種仿制制劑體內(nèi)PK參數(shù)模擬及擬合度比較

Tab.5ComparisonofinvivoparametersimulationandR-squaredamonggenericdrugsfromeightpharmaceuticalcompaniesandreferencelisteddrug

樣品Cmax/(ng· mL-1)tmax/hAUC0-infAUC0-t(μg·h· mL-1)預(yù)測(cè)與實(shí)測(cè)曲線擬合度 (R2)文獻(xiàn)[16]115.002.6201960.61834.2參比制劑114.002.4931974.41931.40.979A63.128.6371716.11668.50.371B61.219.2951692.21644.60.363C100.303.5901923.21878.10.617D56.4610.8301621.31573.60.346E65.777.6801744.51697.10.383

續(xù)表5 參比制劑與8家仿制制劑體內(nèi)PK參數(shù)模擬及擬合度比較

Tab.5ComparisonofinvivoparametersimulationandR-squaredamonggenericdrugsfromeightpharmaceuticalcompaniesandreferencelisteddrug

樣品Cmax/(ng· mL-1)tmax/hAUC0-infAUC0-t(μg·h· mL-1)預(yù)測(cè)與實(shí)測(cè)曲線擬合度 (R2)F83.714.7081856.81810.50.473G66.707.3801753.21705.80.387H71.136.1441787.71740.60.407