肖夢琦，李苗

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，武漢 430075)

近年來,由于空氣污染以及人口老齡化，哮喘及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)病率逐年升高。吸入制劑作為哮喘及COPD的急救用藥，市場發(fā)展前景廣闊，其質(zhì)量關(guān)系到成千上萬患者的生命安全。

硫酸沙丁胺醇是β2受體激動劑，能選擇性作用于支氣管平滑肌[1]并使之松弛，常用于治療支氣管哮喘、COPD[2]、肺氣腫等疾病，常見的劑型有氣霧劑、片劑[3]等。硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑能夠在哮喘急性發(fā)作時迅速緩解支氣管痙攣[4]，為常用平喘藥[5]，近年來在肺部疾病中的應(yīng)用明顯增加[6]，但由于吸入制劑技術(shù)含量高，研發(fā)難度大，國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)較少。目前硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑在國內(nèi)的生產(chǎn)企業(yè)少，通過氟利昂替代的企業(yè)更少，臨床大量使用進(jìn)口藥品且需求量大。因此開展吸入制劑的體外一致性評價方法研究，對該劑型的質(zhì)量與療效一致性評價工作尤為重要。

定量吸入氣霧劑由驅(qū)動器、定量閥和加壓鋁罐組成。微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特性是定量吸入氣霧劑質(zhì)量控制的重要內(nèi)容，利用安德森撞擊器(Anderson Cascade Impactor，ACI)可以對微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特性進(jìn)行評估，《美國藥典》《英國藥典》《歐洲藥典》均收載了該方法，且相關(guān)實驗操作步驟與《中華人民共和國藥典》2015年版的描述大致相同。

ACI由8個收集板及相應(yīng)的8個篩板(0-7級)、F級篩板、連接0級與人工喉錐部、人工喉和底座組成，從0級至7級篩板的孔徑逐級減小，通過各級收集板收集的藥物顆粒量來分析氣霧劑中微細(xì)粒子的粒徑分布情況。筆者在本實驗比較兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特性，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，配四元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器和Empower工作站)；Phenomenex Luna C18(2) 100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)； XS-105電子天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；DFM 2000流量計、ACI(S)、HCP5真空泵(英國Copley公司)；科普利吸入制劑測試數(shù)據(jù)分析軟件(Copley Inhaler Testing Date Analysis Software)；ACI濾膜(英國Copley公司，玻璃纖維濾膜，直徑76 mm，型號：5240) ；SevenEasy pH計[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2試藥 硫酸沙丁胺醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100328-200703，含量：99.3%)；甲醇(Fisher Scientific，色譜純)，無水乙醇、丙三醇、磷酸二氫鈉、磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170728，分析純)；Brij35(聚氧乙烯月桂醚，SIGMA-ALDRICH公司，批號：MKBZ0816V，色譜純)；超純水。硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑(A企業(yè)生產(chǎn)，批號：BB0549；規(guī)格：200撳，按沙丁胺醇計每撳100 μg，無氟利昂配方)；硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑(B企業(yè)生產(chǎn)，批號：1605012，1607041，1608005，1703004，1704001；規(guī)格：200撳，按沙丁胺醇計每撳100 μg，無氟利昂配方)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 HPLC法，使用Phenomenex Luna C18(2) 100A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(0.08 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.10)-甲醇(85：15)；柱溫35 ℃；樣品溫度15 ℃；檢測波長：276 nm；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量100 μL。理論板數(shù)按沙丁胺醇峰計應(yīng)不低于3000[7]。

2.2對照品溶液的制備 取硫酸沙丁胺醇對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL溶液置20 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.3微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特性測定方法 稱取Brij35 3 g，溶于無水乙醇20 mL，精密量取溶液2 mL，與甘油10 g充分混合均勻，制成甘油-Brij35混合液。用移液器吸取甘油-Brij35混合液70 μL，分別置于ACI裝置中每一級收集板上，并用擦鏡紙均勻涂布。

在ACI的F級放入合適的濾膜并用O型環(huán)固定。逐級安裝ACI，L型管(人工喉)的末端與流量計相連，撞擊器下方底座的出口與真空泵相連，應(yīng)保證系統(tǒng)的氣密性。開啟真空泵，調(diào)節(jié)氣體流量，使L型管進(jìn)口處的氣體流速為28.3 L·min-1(±5%)[8]，關(guān)閉真空泵，取下流量計，將合適的吸嘴適配器安裝在L型管的末端，再將驅(qū)動器插入適配器內(nèi)。將藥罐插入另一個驅(qū)動器，振搖5 s后立即噴射1次，共棄去5撳，取下藥罐，開啟真空泵，將藥罐振搖5 s后插入連在L型管上的驅(qū)動器中，立即噴射1次；取下藥罐，振搖5 s，重新插入驅(qū)動器中，噴射第2次；重復(fù)此過程，共噴射10次。精密量取溶劑各10 mL，分別淋洗驅(qū)動器、0-7級各級的篩孔內(nèi)壁和收集板、濾膜和O型環(huán)；精密量取20 mL溶劑潤洗L型管的內(nèi)壁，分別收集上述11份洗液，HPLC進(jìn)樣分析。取A企業(yè)樣品3支、B企業(yè)樣品每個批號各1支，按照上述實驗步驟，每支進(jìn)行2次實驗。

2.4測定結(jié)果 兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細(xì)粒子空氣動力學(xué)測定結(jié)果見表1。

2.5計算結(jié)果 利用Copley Inhaler Testing Date Analysis Software對微細(xì)粒子空氣動力學(xué)測定結(jié)果進(jìn)行計算和分析。由于兩個企業(yè)樣本均較少(n≤10)，且樣本總體分布未知，故采用Wilcoxon Mann-WhitneyU秩和檢驗分析兩個企業(yè)的樣本，采查表法，利用兩樣本比較的秩和檢驗用T界值表判定兩組總體是否有顯著性差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5.1微細(xì)粒子分?jǐn)?shù)(fine particle fraction，F(xiàn)PF) 藥物顆粒直徑>5 μm時被認(rèn)為沉積于口咽部而無法進(jìn)入肺部發(fā)揮作用[9-10]，故FPF按粒徑不超過5 μm的藥物顆粒占藥物遞送量的比例計算。兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的FPF計算結(jié)果見圖1，表2。

根據(jù)表2結(jié)果，秩和檢驗統(tǒng)計量T=21，使用查表法，得單側(cè)檢驗區(qū)間界值為27～75，T不在界值內(nèi)，則P<0.05，B企業(yè)樣品的FPF高于A企業(yè)樣品。

2.5.2空氣動力學(xué)質(zhì)量中位直徑(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(geometric standard deviation，GSD) 兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑MMAD計算結(jié)果見圖2，表3；GSD計算結(jié)果見圖3及表4。

表1 微細(xì)粒子空氣動力學(xué)測定結(jié)果

Tab.1Determinationresultsofaerodynamicsoffineparticleμg·(10撳)-1

企業(yè)產(chǎn)品批號與瓶號驅(qū)動器L管0級1級2級3級4級5級6級7級濾膜A企業(yè)(批號:BB0549) 瓶1-1105.40606.0329.8017.0120.4073.56115.4156.988.711.451.04 瓶1-2124.23510.3630.5214.1619.1777.68124.0562.448.231.811.05 瓶2-1102.46529.0012.8611.8317.6668.90102.7543.195.660.970.70 瓶2-2135.71547.8139.7920.6024.3375.9999.1337.066.681.730.74 瓶3-1129.22453.1129.0117.5323.3985.35108.2043.117.031.750.80 瓶3-2133.23524.7433.3517.1721.5777.12103.1740.796.331.701.55B企業(yè)(批號:1605012) 1605012-157.44587.5212.289.50113.4773.48167.96107.2312.842.100.88 1605012-248.64599.0612.789.6712.3468.38150.8492.5112.502.170.90 1607041-178.26552.9612.848.1112.9074.17167.0587.9110.211.750.86 1607041-276.31581.2512.379.6911.9166.07151.5478.639.501.980.95 1608005-148.79617.497.086.8710.3469.53183.67109.7911.771.920.61 1608005-251.32642.528.137.5210.6368.45183.5886.6310.332.760.71 1704001-147.36543.4513.0410.0012.6478.57176.6090.0210.522.491.48 1704001-255.96584.237.856.659.6854.81142.5493.2911.362.951.17 1703004-183.50523.2321.0812.9818.3686.48146.6665.378.861.460.59 1703004-2115.60536.2610.848.7814.5975.21141.0568.339.142.691.29

圖1 空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

Fig.1Resultsofaerodynamicsoffineparticlefraction(FPF)

根據(jù)表3、表4結(jié)果，秩和檢驗統(tǒng)計量分別為T=81與T=79.5，采用查表法，得單側(cè)檢驗區(qū)間界值為27～75，T不在界值內(nèi)，則P<0.05，A企業(yè)樣品的MMAD與GSD均大于B企業(yè)樣品，因此認(rèn)為兩種氣霧劑微細(xì)粒子的粒徑分布情況存在差異。

表2 FPF計算結(jié)果

Tab.2FPFresults%

2.5.3各級藥物沉積量(μg)所占比例 從圖4可知，與A企業(yè)樣品比較，B企業(yè)樣品藥物顆粒在0～2級沉積量較低，在4～6級沉積量較高，且殘留于驅(qū)動器的比例較?。欢咚幬镱w粒在7級和濾膜上的沉積量較接近。

2.6數(shù)學(xué)模型 藥物顆粒直徑>5 μm時被認(rèn)為沉積于口咽部而無法進(jìn)入肺部發(fā)揮作用，直徑<1 μm時又被呼出也不能發(fā)揮作用。因此以ACI撞擊器2～6級在氣流量為28.3 L·min-1時截止粒徑為橫坐標(biāo)(X)，以2～6級的藥物沉積量為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行3次回歸，

圖2 空氣動力學(xué)質(zhì)量中位直徑計算結(jié)果

圖3 空氣動力學(xué)微細(xì)粒子幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差計算結(jié)果

Fig.3GSDresults

建立了空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布方程為Y=aX3+bX2+cX+K，R2≥0.98，各樣品的擬合曲線見圖5。

由表5和表6可見，A企業(yè)樣品微細(xì)粒子在各層級藥物沉積量的曲線與分布方程擬合程度較好，各條曲線相關(guān)系數(shù)均>0.98；B企業(yè)樣品各層級藥物沉積量曲線與分布方程擬合程度不夠好，各條曲線的相關(guān)系數(shù)絕大部分<0.98且彼此差異較大。說明A企業(yè)樣品的微細(xì)粒子層級分布存在規(guī)律，且測定結(jié)果差異較小，而B企業(yè)樣品微細(xì)粒子層級分布規(guī)律性不強(qiáng)，結(jié)果較雜亂。

表3 空氣動力學(xué)質(zhì)量中位直徑計算結(jié)果

Tab.3MMADresultsμm

表4 幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)計算結(jié)果

使用空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布方程可以表征MDI空氣動力學(xué)微細(xì)粒子層級分布特征，通過進(jìn)一步驗證和完善，可能成為評價MDI仿制藥與原研藥空氣動力學(xué)特性一致性的有效手段。

3 討論

兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑的微細(xì)粒子在粒徑分布上存在差異。B企業(yè)樣品的FPF高于A企業(yè)樣品，但A企業(yè)樣品的的微細(xì)粒子層級分布規(guī)律性強(qiáng)于B企業(yè)樣品，可采用體外撞擊實驗和空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布方程將樣品繼續(xù)與原研藥進(jìn)行比較研究，對本品空氣動力學(xué)特性的一致性進(jìn)行體外評價，為臨床療效的一致性評價提供參考。

將兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑放入冰箱冷凍過夜后，取出鋁罐，立即在罐的閥門上鉆兩個小孔排氣。待罐內(nèi)氣體排盡后，割開鋁罐，觀察到明顯不同：①A企業(yè)樣品罐內(nèi)留有白色藥物粉末團(tuán)塊，未見液體，而B企業(yè)樣品罐內(nèi)留有類白色混懸液，取出后靜置分層，可見兩種樣品的處方明顯不同；②A企業(yè)樣品的閥門處明顯殘留藥物粉末，沾滿閥門內(nèi)壁，而B企業(yè)樣品的閥門內(nèi)僅殘留極少的藥物粉末，可能跟閥門的材料不同有關(guān)；③兩種樣品的閥門結(jié)構(gòu)不同，A企業(yè)樣品與B企業(yè)樣品的閥門長度分別為8.0 mm和8.5 mm，閥門孔徑基本相同，均約為1 mm；④兩種樣品的驅(qū)動器噴嘴孔徑不同，A企業(yè)樣品的驅(qū)動器噴嘴孔徑大于B企業(yè)樣品。上述不同之處可能也是導(dǎo)致兩種樣品的微細(xì)粒子分布不同的主要原因。

圖4 各級藥物沉積量比例

圖5 空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布曲線

表5 A企業(yè)樣品空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布方程

Tab.5DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromAcompany

瓶號(批號:BB0549)abckR2瓶1-17.49-83.4257-1290.985瓶1-28.16-90.9279-1400.983瓶2-16.53-73.8231-1220.994瓶2-25.95-68.2219-1170.998瓶3-16.55-75.4242-1290.999瓶3-26.37-72.7222-1230.999平均6.8-77.4242-1270.993RSD/%12.010.79.56.30.7

表6 B企業(yè)樣品空氣動力學(xué)微細(xì)粒子分布方程

Tab.6DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromBcompany

批號與瓶號abckR21605012-112.1-120379-1750.9161605012-210.7-116310-1580.9291607041-111.9-128381-1870.9411607041-210.8-117346-1690.9391608005-113.5-144419-1980.9081608005-213.3-143420-2100.9221704001-112.6-137406-2010.9461704001-210.4-111320-1450.8951703004-19.80-109334-1720.9841703004-29.60-106320-1610.971平均11.5-123364-1780.935RSD/%12.311.411.811.82.9

除微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特性之外，還可以從遞送劑量均一性、每瓶總撳次、每撳重量、水分等方面進(jìn)行深入研究，以更全面地評價兩種硫酸沙丁胺醇定量吸入氣霧劑質(zhì)量的一致性。