殷亞妮 許東升 吉祖筠 曹安康

（南京師范大學(xué)附屬中學(xué) 江蘇南京 210003）

酵母菌固定化是學(xué)生親自體驗(yàn)和實(shí)踐固定化技術(shù)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，充滿趣味，特別是實(shí)驗(yàn)成功后得到的充滿彈性的凝膠珠，更是深受學(xué)生喜愛(ài)。但學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中也遇到很多難題，例如海藻酸鈉加熱時(shí)易焦糊，凝膠珠易拖尾或形狀大小不一，發(fā)酵過(guò)程中凝膠珠易破裂等，針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探究和改進(jìn)。

1 比較實(shí)驗(yàn)效果，確定最適條件

1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)凝膠珠形成和酵母菌固定化的影響 人教版教材中要求“稱取0.7 g 海藻酸鈉……加入10 mL 水……直至完全溶化，用蒸餾水定容至10 mL”，即海藻酸鈉溶液濃度為7%。為了解海藻酸鈉濃度對(duì)酵母菌固定化效果的影響，配制了3 組濃度為4%、7%和10%的海藻酸鈉溶液，分別與等體積的酵母菌液混合均勻，并用注射器將混合液滴加到0.05 mol／L 的CaCl2溶液中固定30 min，制成凝膠珠。

1.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)于凝膠珠形狀的影響首先，比較凝膠珠成形效果（表1），發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度越低，凝膠珠越易形成規(guī)則球形，濃度過(guò)高時(shí)，拖尾嚴(yán)重，呈蝌蚪狀。推測(cè)濃度低時(shí)，溶液黏著性低，易從注射器口處滴落，且在溶液表面張力作用下，能在下落過(guò)程中快速形成球形；而隨著濃度升高，溶液黏著性增加，無(wú)法快速?gòu)淖⑸淦骺诘温?，易拖尾，凝膠珠成形效果較差。

表1 海藻酸鈉濃度對(duì)凝膠珠成形的影響

稱取上述3 種凝膠珠各4 g，分別置于50 mL 10%的葡萄糖溶液中進(jìn)行酒精發(fā)酵。連續(xù)10 d，在每天同一時(shí)間觀察凝膠珠的狀態(tài)并測(cè)量發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度為4%和7%的海藻酸鈉溶液形成的凝膠珠形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間都未發(fā)生破裂，但10%的海藻酸鈉溶液形成的凝膠珠在發(fā)酵1 d 后有部分破裂，且頭部直徑越大的凝膠珠越容易破裂（圖1）。

圖1 不同濃度海藻酸鈉固定得到的凝膠珠

1.1.2 海藻酸鈉濃度對(duì)酵母菌固定化的影響 對(duì)比發(fā)酵液中游離的酵母菌數(shù)量（表2），發(fā)酵前期，10%海藻酸鈉組高于其他2 組，且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，數(shù)量不斷增加；但在發(fā)酵后期（發(fā)酵7～10 d 該組的數(shù)值無(wú)明顯變化，推測(cè)可能與該組凝膠珠在前期逐漸發(fā)生破裂有關(guān)。4%海藻酸鈉組和7%海藻酸鈉組在發(fā)酵前期數(shù)值都較低；但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，4%海藻酸鈉組的游離酵母菌數(shù)呈顯著上升趨勢(shì)，與前期相比，增幅為20～30 倍；而7%海藻酸鈉組的數(shù)目?jī)H增加2～3 倍?？紤]到酵母菌在無(wú)氧條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵產(chǎn)能較少，不利于其增殖，可以推測(cè)4%海藻酸鈉組的游離酵母菌多來(lái)自于凝膠珠，說(shuō)明海藻酸鈉濃度過(guò)低時(shí)，形成的凝膠珠孔徑較大，酵母菌容易泄漏，固定效果并不理想。

表2 發(fā)酵液中游離酵母菌數(shù)（個(gè)／mL）

綜上所述，從凝膠珠成形和酵母菌固定效果等方面綜合考慮，在4%、7%、10%的3 個(gè)濃度中，7%的海藻酸鈉更適合用于固定酵母菌。

1.2 固定化時(shí)間對(duì)酵母菌固定化的影響 CaCl2溶液使凝膠珠成形的原理是，CaCl2溶液中的Ca2+與海藻酸鈉發(fā)生反應(yīng)，迅速在表面形成了交聯(lián)的海藻酸鈣聚合物［1］，充分浸泡后，Ca2+與海藻酸中的多個(gè)氧原子發(fā)生螯合作用，使海藻酸鏈間結(jié)合得更加緊密（圖2）［2］，并最終導(dǎo)致凝膠珠的形成。品質(zhì)良好的凝膠珠應(yīng)該具有一定的彈性，且能在發(fā)酵過(guò)程中很好地維持自身形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖2 海藻酸鈉和海藻酸鈣的結(jié)構(gòu)差異［2］

1.2.1 固定化時(shí)間對(duì)凝膠珠形態(tài)的影響 教材建議用0.05 mol／L 的CaCl2固定30 min，若改變固定化的時(shí)間，會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響？設(shè)置5 組不同的固定化時(shí)間，分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組凝膠珠的直徑（表3），發(fā)現(xiàn)凝膠珠的直徑隨固定化時(shí)間的增加而變小，推測(cè)是因?yàn)楣潭ɑ瘯r(shí)間越長(zhǎng)，Ca2+與海藻酸鈉反應(yīng)越充分，形成了更多不易溶于水的海藻酸鈣彼此交聯(lián)在一起，使得凝膠珠結(jié)構(gòu)更緊湊。

表3 固定化時(shí)間與凝膠珠直徑的關(guān)系

1.2.2 固定化時(shí)間對(duì)酵母菌固定效果的影響為了解固定化時(shí)間對(duì)酵母菌固定效果的影響，稱取上述5 組凝膠珠各4 g，分別在50 mL 10%的葡萄糖溶液中發(fā)酵，連續(xù)10 d，每天同一時(shí)間觀察凝膠珠狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)固定10 min 的凝膠珠從發(fā)酵第1 天起有40%的凝膠珠破裂（圖3）；發(fā)酵3 d后有少量凝膠珠沉于發(fā)酵液底部，并隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，破裂及下沉凝膠珠比例不斷增加；發(fā)酵7 d 后，所有凝膠珠都沉底，另外4 組的凝膠珠則無(wú)破裂和沉底現(xiàn)象?？梢?jiàn)，固定化時(shí)間過(guò)短（10 min），凝膠珠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易在發(fā)酵中破裂，并在一定程度上增加酵母菌的泄漏。

圖3 固定10 min 的凝膠珠發(fā)酵中大量破裂

同時(shí)，每天同一時(shí)間測(cè)量發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)固定化時(shí)間越長(zhǎng)的凝膠珠，其發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量越少，但幾組的酵母菌數(shù)量差異并不大，最多相差2～3 倍。

結(jié)合海藻酸鈉濃度的實(shí)驗(yàn)，可得出結(jié)論：海藻酸鈉濃度是影響包埋孔徑，防止酵母菌泄漏流失的主要因素；合適的固定化時(shí)間則是凝膠珠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的保證；固定化時(shí)間在20～50 min 時(shí)，無(wú)顯著差異，考慮時(shí)間成本，建議大家在使用0.05 mol／L 的CaCl2溶液固定凝膠珠時(shí)，時(shí)間以20～30 min 為宜。

2 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作 提高實(shí)驗(yàn)效率

2.1 改變海藻酸鈉的加熱方式 常溫下，海藻酸鈉不易溶解，需要加熱，人教版教材中建議用“酒精燈進(jìn)行加熱，邊加熱邊攪拌......且加熱時(shí)要用小火，或者間斷加熱，反復(fù)幾次，直到溶化為止”。但實(shí)際操作中，酒精燈火焰大小無(wú)法控制，只能采用間隔加熱的方式，時(shí)不時(shí)用試管夾將小燒杯從火焰正上方平行移走，學(xué)生無(wú)法靈活掌握加熱時(shí)間，很容易出現(xiàn)海藻酸鈉焦糊并黏著在燒杯底部的情況。因此，改用恒溫水浴鍋進(jìn)行加熱，當(dāng)水溫為60℃時(shí)，20 mL 規(guī)定濃度的海藻酸鈉徹底溶化只需3～5 min，且不會(huì)焦糊。與酒精燈加熱相比，水浴加熱易于控制熱量大小，海藻酸鈉溶液的水分揮發(fā)也相對(duì)較少，能保持其濃度［3-4］。

2.2 有效縮短固定化時(shí)間 能否在保證固定效果的前提下適當(dāng)縮短固定化時(shí)間？考慮到凝膠珠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與海藻酸鈣的形成有關(guān)，嘗試通過(guò)增加CaCl2溶液的濃度縮短固定化時(shí)間，設(shè)置了3組實(shí)驗(yàn)，分別為0.05 mol／L CaCl2固定化30 min，0.1 mol／L CaCl2固定化15 min，及0.2 mol／L CaCl2固定化7.5 min。得到凝膠珠后分別加入葡萄糖溶液進(jìn)行發(fā)酵，在10 d 的發(fā)酵過(guò)程中，3 組凝膠珠都未出現(xiàn)破裂和下沉現(xiàn)象，甚至在實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 個(gè)月后，3 組凝膠珠的形態(tài)依然保持完好，無(wú)明顯差別，故可通過(guò)提高CaCl2濃度縮短固定化時(shí)間節(jié)約課時(shí)。

2.3 設(shè)計(jì)并制作固定化酵母菌簡(jiǎn)易裝置 制作凝膠珠時(shí)，教材要求“以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中”，此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)注射器的高度和角度也會(huì)影響凝膠珠的形狀。學(xué)生初次操作，很難保證滴定速度的“恒定”和“緩慢”，導(dǎo)致凝膠珠大小不一，內(nèi)部氣泡過(guò)多等。針對(duì)這些問(wèn)題，利用常用的學(xué)習(xí)工具和實(shí)驗(yàn)工具制作簡(jiǎn)易的酵母菌固定化裝置（圖4）。該裝置搭建和操作方式如下：

圖4 酵母菌固定化簡(jiǎn)易裝置

1）用注射器吸取已經(jīng)混合好的海藻酸鈉與酵母菌溶液，吸取時(shí)要避免注射管中產(chǎn)生氣泡，然后將注射器滴注口的混合溶液擦拭干凈備用。

2）用試管夾夾持注射器，并將其垂直固定在距離CaCl2溶液一定高度的位置，觀察注射器的活塞軸在重力下移動(dòng)情況。

3）將小件重物（例如小砝碼、橡皮塊等）壓在注射器的活塞柄上，觀察活塞軸移動(dòng)情況，可通過(guò)調(diào)換重物，改變壓力大小，使活塞軸緩慢、勻速向下移動(dòng)，將混合溶液排出注射器，即可以制備出形態(tài)大小均一的凝膠珠。

3 結(jié)論與展望

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 海藻酸鈉用酒精燈火加熱溶解時(shí)，火勢(shì)大小難以控制，易發(fā)生焦糊，可用恒溫水浴鍋（設(shè)定水溫為60℃）進(jìn)行加熱。

隨著海藻酸鈉濃度的增加，凝膠珠孔徑逐漸減小，酵母菌越難泄漏，固定效果越好；但同時(shí)混合液粘稠度增加，拖尾嚴(yán)重，凝膠珠成形效果較差。綜合而言，濃度為7%的海藻酸鈉溶液比4%和10%的更適合固定酵母菌。

凝膠珠在CaCl2溶液中的固定化時(shí)間越長(zhǎng)，凝膠珠形態(tài)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越不易破裂。一般而言，在0.05 mol／L 的CaCl2溶液中需固定20～30 min，但若增加CaCl2溶液的濃度，則固定化時(shí)間可等比減少，例如在2 mol／L 的CaCl2溶液中只需固定7.5 min。

3.2 展望 可以考慮研究相同條件下，固定化的酵母菌和游離的酵母菌在增殖和發(fā)酵方面的差別，例如酒精的產(chǎn)生效率是否相同等。