丁煜哲 田 坤

（西安高新第一中學(xué) 陜西西安 710000）

1 引出問(wèn)題

鹽代謝紊亂是目前公認(rèn)的對(duì)心腦血管和腎臟產(chǎn)生損害，是引起冠心病、中風(fēng)和腎衰竭等的重要風(fēng)險(xiǎn)因子［1-2］，人們選擇降低食鹽的攝入量，以減少鹽代謝紊亂可能帶來(lái)的疾病風(fēng)險(xiǎn)。然而，在已有的細(xì)胞與動(dòng)物研究中，食鹽的使用濃度非常寬泛（20～160 mmol／L）［3-5］，高濃度食鹽的使用會(huì)引起研究系統(tǒng)內(nèi)的滲透壓改變，從而過(guò)高評(píng)估食鹽所帶來(lái)的危害。如何選取合理的食鹽刺激與給予濃度，是正確評(píng)估食鹽毒性的關(guān)鍵因素。本項(xiàng)目利用人血管內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC），對(duì)比了不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞形態(tài)改變與細(xì)胞凋亡情況，證明了選擇合理鹽濃度刺激的重要性；同時(shí)根據(jù)篩選的最優(yōu)鹽濃度，檢測(cè)了在該濃度刺激條件下，食鹽對(duì)細(xì)胞活力、增殖以及凋亡的影響。食鹽的主要成分是氯化鈉，為了便于控制濃度，本文選用分析純的氯化鈉作為食鹽用于之后的研究中。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUVEC 細(xì)胞系購(gòu)于上海生命科學(xué)院菌種保存中心；氯化鈉、蔗糖等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；Cell Counting Kit-8 細(xì)胞增殖試劑盒及Annexin-V&PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；主要科研平臺(tái)借助西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察 以1×105個(gè)／孔為濃度，將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)給予不同濃度（0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L）的食鹽刺激，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h 和72 h 進(jìn)行觀察、拍照。

2.2.2 Countstar 細(xì)胞活力評(píng)估 以1×105個(gè)/孔為濃度，將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol／L蔗糖和60 mmol／L 氯化鈉刺激，24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后，5 min 內(nèi)在Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析。

2.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖以1×104個(gè)/孔為濃度，漿細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol／L蔗糖和60 mmol/L氯化鈉刺激，在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 和72 h 后 加 入10 μL 的CCK-8染色，37℃孵育1 h 后，在酶標(biāo)儀中用450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

2.2.4 Annexin-V&PI 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以1×105個(gè)/孔為濃度，將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol/L 蔗糖和60 mmol／L 氯化鈉刺激，72 h 后胰酶消化收集細(xì)胞，離心后棄去上清液，加入200 μL Binding Buffer，充分混勻，再加入10 μL Annexin V-FITC，以及5 μL PI 輕輕混勻避光，置于4℃下反應(yīng)30 min，1 h 內(nèi)流式上機(jī)檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞形態(tài)變化 根據(jù)文獻(xiàn)中經(jīng)常使用的鹽濃度，筆者選擇了0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L 作為刺激條件，觀察不同時(shí)間刺激后，HUVEC 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化。主要基于高濃度的食鹽刺激，必然引起細(xì)胞的失水，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生較大的變化，結(jié)果如下圖1所示。細(xì)胞在160 mmol／L 的鹽刺激條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都受到明顯抑制，細(xì)胞形態(tài)不均一，推測(cè)可能出現(xiàn)凋亡與壞死；80 mmol／L 的鹽刺激條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)在72 h 稍微出現(xiàn)抑制，而形態(tài)改變并不明顯；在其余濃度與時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)密度都沒(méi)有明顯異常。

圖1 不同濃度氯化鈉刺激的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（200×）

3.2 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)食鹽高濃度刺激下的細(xì)胞狀態(tài)，筆者推測(cè)細(xì)胞可能已處于凋亡或壞死狀態(tài)，為此，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V 和PI 的共染，證明此時(shí)的細(xì)胞凋亡與壞死情況，結(jié)果如圖2（見(jiàn)封四）所示。

根據(jù)圖2所示，細(xì)胞在160 mmol／L和80 mmol／L的2 個(gè)點(diǎn)都出現(xiàn)了大幅度的細(xì)胞凋亡與壞死，說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞是由于滲透壓改變出現(xiàn)的整體性凋亡與壞死，而其余濃度下細(xì)胞凋亡與壞死并不顯著。需要強(qiáng)調(diào)的是，因?yàn)镠UVEC 屬于貼壁細(xì)胞，胰酶消化會(huì)造成部分細(xì)胞的凋亡與壞死，所以對(duì)照中盡管沒(méi)有食鹽刺激，但還是有少許的凋亡與壞死存在。結(jié)合圖1 和圖2，筆者認(rèn)為60 mmol／L 是一個(gè)比較理想的刺激濃度，一方面保證了較高的食鹽濃度，另一方面并不因滲透壓的改變而對(duì)細(xì)胞造成整體性影響。之后的實(shí)驗(yàn)中選擇該濃度為最適的食鹽刺激濃度。

圖2 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞凋亡與壞死情況（200×）

3.3 60 mmol／L 食鹽刺激下的細(xì)胞活力 在確定了適合的鹽濃度后，該濃度的食鹽刺激會(huì)對(duì)細(xì)胞活力有何影響？除了選擇60 mmol／L 的食鹽刺激，在對(duì)照組中加入了同樣濃度的蔗糖，以排除可能的微小的滲透壓影響，結(jié)果如圖3 和表1所示。

圖3 蔗糖和氯化鈉最優(yōu)刺激濃度下細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后結(jié)果比較（200×）

表1 60 mmol／L 蔗糖與氯化鈉刺激下的細(xì)胞活力參數(shù)

根據(jù)圖3 和表1 的結(jié)果，相比較于60 mmol／L的蔗糖刺激，氯化鈉對(duì)于細(xì)胞的活力的影響非常有限，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，2 組細(xì)胞間的差異不大，只有微小的細(xì)胞活率降低，而細(xì)胞直徑、平均圓度等都不受影響。

3.4 60 mmol／L 食鹽刺激下的細(xì)胞增殖 在觀察了細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞活力后，利用CCK-8 試劑盒檢測(cè)了60 mmol／L 氯化鈉對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖的影響，同樣選擇60 mmol／L 的蔗糖作為對(duì)照，按照實(shí)驗(yàn)方法介紹的步驟，獲得了12 h、24 h、48 h 和72 h 的光吸收值，根據(jù)光吸收值的大小，說(shuō)明細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)圖4 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在72 h 時(shí)氯化鈉刺激組表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制，而在其他時(shí)間點(diǎn)并未出現(xiàn)，說(shuō)明氯化鈉對(duì)細(xì)胞增殖的影響是需要一定時(shí)間積累才會(huì)出現(xiàn)，也證實(shí)食鹽的毒害作用可能隨著時(shí)間的推移逐步積累。

圖4 最優(yōu)濃度下氯化鈉對(duì)細(xì)胞增殖的影響

4 實(shí)驗(yàn)討論

本項(xiàng)目作為一個(gè)高中生研究性的學(xué)習(xí)案例，在關(guān)注食鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，以往的課題研究在食鹽濃度的選擇上非常寬泛，考慮到滲透壓改變可能會(huì)帶來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)的致命性損害，盡管食鹽本身也能帶來(lái)滲透壓的損害，但這種損害是在一定程度內(nèi)，人類也可以通過(guò)增加攝水調(diào)整食鹽濃度，但過(guò)高鹽濃度使用結(jié)論會(huì)誤導(dǎo)大眾對(duì)食鹽毒性的認(rèn)識(shí)，且過(guò)度的降低食鹽攝取同樣危害健康；同時(shí)為了尋找最優(yōu)的食鹽作用濃度，本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)觀察，細(xì)胞活力、增殖和凋亡的檢測(cè)證明60 mmol／L 是一個(gè)比較理想的食鹽作用濃度。本項(xiàng)目能解決研究食鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究時(shí)在選擇合理食鹽濃度的困惑，但是食鹽對(duì)機(jī)體的影響是復(fù)雜的，不僅限于內(nèi)皮細(xì)胞，機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互做模式，之后還需要更為深入的研究；同時(shí)對(duì)于參與項(xiàng)目學(xué)習(xí)的高中生而言，對(duì)于滲透壓，以及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡的研究也有利于加強(qiáng)對(duì)這些概念的理解。