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        滲透壓變化在食鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究中的重要性探討

        2019-07-08 06:04:10丁煜哲
        生物學(xué)通報(bào) 2019年7期

        丁煜哲 田 坤

        (西安高新第一中學(xué) 陜西西安 710000)

        1 引出問(wèn)題

        鹽代謝紊亂是目前公認(rèn)的對(duì)心腦血管和腎臟產(chǎn)生損害,是引起冠心病、中風(fēng)和腎衰竭等的重要風(fēng)險(xiǎn)因子[1-2],人們選擇降低食鹽的攝入量,以減少鹽代謝紊亂可能帶來(lái)的疾病風(fēng)險(xiǎn)。然而,在已有的細(xì)胞與動(dòng)物研究中,食鹽的使用濃度非常寬泛(20~160 mmol/L)[3-5],高濃度食鹽的使用會(huì)引起研究系統(tǒng)內(nèi)的滲透壓改變,從而過(guò)高評(píng)估食鹽所帶來(lái)的危害。如何選取合理的食鹽刺激與給予濃度,是正確評(píng)估食鹽毒性的關(guān)鍵因素。本項(xiàng)目利用人血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC),對(duì)比了不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞形態(tài)改變與細(xì)胞凋亡情況,證明了選擇合理鹽濃度刺激的重要性;同時(shí)根據(jù)篩選的最優(yōu)鹽濃度,檢測(cè)了在該濃度刺激條件下,食鹽對(duì)細(xì)胞活力、增殖以及凋亡的影響。食鹽的主要成分是氯化鈉,為了便于控制濃度,本文選用分析純的氯化鈉作為食鹽用于之后的研究中。

        2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

        2.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUVEC 細(xì)胞系購(gòu)于上海生命科學(xué)院菌種保存中心;氯化鈉、蔗糖等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán);Cell Counting Kit-8 細(xì)胞增殖試劑盒及Annexin-V&PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司;主要科研平臺(tái)借助西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室。

        2.2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1 倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察 以1×105個(gè)/孔為濃度,將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,同時(shí)給予不同濃度(0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 和160 mmol/L)的食鹽刺激,分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h 和72 h 進(jìn)行觀察、拍照。

        2.2.2 Countstar 細(xì)胞活力評(píng)估 以1×105個(gè)/孔為濃度,將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別給予60 mmol/L蔗糖和60 mmol/L 氯化鈉刺激,24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞,用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后,5 min 內(nèi)在Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析。

        2.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖以1×104個(gè)/孔為濃度,漿細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別給予60 mmol/L蔗糖和60 mmol/L氯化鈉刺激,在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 和72 h 后 加 入10 μL 的CCK-8染色,37℃孵育1 h 后,在酶標(biāo)儀中用450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

        2.2.4 Annexin-V&PI 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以1×105個(gè)/孔為濃度,將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別給予60 mmol/L 蔗糖和60 mmol/L 氯化鈉刺激,72 h 后胰酶消化收集細(xì)胞,離心后棄去上清液,加入200 μL Binding Buffer,充分混勻,再加入10 μL Annexin V-FITC,以及5 μL PI 輕輕混勻避光,置于4℃下反應(yīng)30 min,1 h 內(nèi)流式上機(jī)檢測(cè)。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞形態(tài)變化 根據(jù)文獻(xiàn)中經(jīng)常使用的鹽濃度,筆者選擇了0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L 和160 mmol/L 作為刺激條件,觀察不同時(shí)間刺激后,HUVEC 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化。主要基于高濃度的食鹽刺激,必然引起細(xì)胞的失水,細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生較大的變化,結(jié)果如下圖1所示。細(xì)胞在160 mmol/L 的鹽刺激條件下,細(xì)胞生長(zhǎng)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都受到明顯抑制,細(xì)胞形態(tài)不均一,推測(cè)可能出現(xiàn)凋亡與壞死;80 mmol/L 的鹽刺激條件下,細(xì)胞生長(zhǎng)在72 h 稍微出現(xiàn)抑制,而形態(tài)改變并不明顯;在其余濃度與時(shí)間點(diǎn),細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)密度都沒(méi)有明顯異常。

        圖1 不同濃度氯化鈉刺激的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(200×)

        3.2 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)食鹽高濃度刺激下的細(xì)胞狀態(tài),筆者推測(cè)細(xì)胞可能已處于凋亡或壞死狀態(tài),為此,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V 和PI 的共染,證明此時(shí)的細(xì)胞凋亡與壞死情況,結(jié)果如圖2(見(jiàn)封四)所示。

        根據(jù)圖2所示,細(xì)胞在160 mmol/L和80 mmol/L的2 個(gè)點(diǎn)都出現(xiàn)了大幅度的細(xì)胞凋亡與壞死,說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞是由于滲透壓改變出現(xiàn)的整體性凋亡與壞死,而其余濃度下細(xì)胞凋亡與壞死并不顯著。需要強(qiáng)調(diào)的是,因?yàn)镠UVEC 屬于貼壁細(xì)胞,胰酶消化會(huì)造成部分細(xì)胞的凋亡與壞死,所以對(duì)照中盡管沒(méi)有食鹽刺激,但還是有少許的凋亡與壞死存在。結(jié)合圖1 和圖2,筆者認(rèn)為60 mmol/L 是一個(gè)比較理想的刺激濃度,一方面保證了較高的食鹽濃度,另一方面并不因滲透壓的改變而對(duì)細(xì)胞造成整體性影響。之后的實(shí)驗(yàn)中選擇該濃度為最適的食鹽刺激濃度。

        圖2 不同鹽濃度刺激下的細(xì)胞凋亡與壞死情況(200×)

        3.3 60 mmol/L 食鹽刺激下的細(xì)胞活力 在確定了適合的鹽濃度后,該濃度的食鹽刺激會(huì)對(duì)細(xì)胞活力有何影響?除了選擇60 mmol/L 的食鹽刺激,在對(duì)照組中加入了同樣濃度的蔗糖,以排除可能的微小的滲透壓影響,結(jié)果如圖3 和表1所示。

        圖3 蔗糖和氯化鈉最優(yōu)刺激濃度下細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后結(jié)果比較(200×)

        表1 60 mmol/L 蔗糖與氯化鈉刺激下的細(xì)胞活力參數(shù)

        根據(jù)圖3 和表1 的結(jié)果,相比較于60 mmol/L的蔗糖刺激,氯化鈉對(duì)于細(xì)胞的活力的影響非常有限,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后,2 組細(xì)胞間的差異不大,只有微小的細(xì)胞活率降低,而細(xì)胞直徑、平均圓度等都不受影響。

        3.4 60 mmol/L 食鹽刺激下的細(xì)胞增殖 在觀察了細(xì)胞形態(tài),檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞活力后,利用CCK-8 試劑盒檢測(cè)了60 mmol/L 氯化鈉對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖的影響,同樣選擇60 mmol/L 的蔗糖作為對(duì)照,按照實(shí)驗(yàn)方法介紹的步驟,獲得了12 h、24 h、48 h 和72 h 的光吸收值,根據(jù)光吸收值的大小,說(shuō)明細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果如圖4所示。

        根據(jù)圖4 結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在72 h 時(shí)氯化鈉刺激組表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制,而在其他時(shí)間點(diǎn)并未出現(xiàn),說(shuō)明氯化鈉對(duì)細(xì)胞增殖的影響是需要一定時(shí)間積累才會(huì)出現(xiàn),也證實(shí)食鹽的毒害作用可能隨著時(shí)間的推移逐步積累。

        圖4 最優(yōu)濃度下氯化鈉對(duì)細(xì)胞增殖的影響

        4 實(shí)驗(yàn)討論

        本項(xiàng)目作為一個(gè)高中生研究性的學(xué)習(xí)案例,在關(guān)注食鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究時(shí)發(fā)現(xiàn),以往的課題研究在食鹽濃度的選擇上非常寬泛,考慮到滲透壓改變可能會(huì)帶來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)的致命性損害,盡管食鹽本身也能帶來(lái)滲透壓的損害,但這種損害是在一定程度內(nèi),人類也可以通過(guò)增加攝水調(diào)整食鹽濃度,但過(guò)高鹽濃度使用結(jié)論會(huì)誤導(dǎo)大眾對(duì)食鹽毒性的認(rèn)識(shí),且過(guò)度的降低食鹽攝取同樣危害健康;同時(shí)為了尋找最優(yōu)的食鹽作用濃度,本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)觀察,細(xì)胞活力、增殖和凋亡的檢測(cè)證明60 mmol/L 是一個(gè)比較理想的食鹽作用濃度。本項(xiàng)目能解決研究食鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究時(shí)在選擇合理食鹽濃度的困惑,但是食鹽對(duì)機(jī)體的影響是復(fù)雜的,不僅限于內(nèi)皮細(xì)胞,機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互做模式,之后還需要更為深入的研究;同時(shí)對(duì)于參與項(xiàng)目學(xué)習(xí)的高中生而言,對(duì)于滲透壓,以及細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡的研究也有利于加強(qiáng)對(duì)這些概念的理解。

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