莫遠(yuǎn)亮，王郁石，王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）是基于熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析[1]的方法，該方法具有快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)、通量大等特點(diǎn)，在當(dāng)今生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。在RT-qPCR應(yīng)用中，由于不同樣品間RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率及PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率等存在差別，從而影響定量分析的準(zhǔn)確性，因此需要引入穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因予以校正[2]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是在所研究的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)條件下均能夠恒定表達(dá)的基因[3]。但是，由于內(nèi)參基因的表達(dá)具有物種、組織及階段特異性，不存在通用于多種細(xì)胞、組織和實(shí)驗(yàn)條件的內(nèi)參基因。如若使用未經(jīng)篩選驗(yàn)證的內(nèi)參基因進(jìn)行校正，則目標(biāo)基因表達(dá)水平的定量分析可能出現(xiàn)較大的偏差[4]。因此，需要根據(jù)細(xì)胞和組織類型、細(xì)胞增殖和器官發(fā)育的階段、實(shí)驗(yàn)條件的不同，篩選出相對(duì)合適的內(nèi)參基因及確定其數(shù)目，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得準(zhǔn)確可靠的基因表達(dá)分析[5]。

KHAN等[6]在對(duì)牛的優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞的內(nèi)參基因表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，UBE2D2和EIF2B2在分娩期和卵泡成熟期表達(dá)較為穩(wěn)定。BADDELA等[7]對(duì)牛的顆粒細(xì)胞在不同氧濃度和不同密度培養(yǎng)條件下做了內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)TBP和B2M在2種條件下均能穩(wěn)定表達(dá)。Lü等[8]為篩選在正常和多囊卵巢綜合征患者的顆粒細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，從15個(gè)常用內(nèi)參基因中篩選出了HPRT1、PRLP0、HMBS3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。目前有關(guān)顆粒細(xì)胞內(nèi)參基因選擇的研究報(bào)道相對(duì)較少。顆粒細(xì)胞對(duì)禽類卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，而禽類的卵泡發(fā)育遵循嚴(yán)格的等級(jí)發(fā)育制度[9-10]，因此，研究顆粒細(xì)胞在不同階段各基因的表達(dá)水平對(duì)探究禽類卵泡的選擇募集機(jī)制具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，部分常用內(nèi)參基因GAPDH、TUB、B2M在不同階段顆粒細(xì)胞中表達(dá)不穩(wěn)定。因此，本文以天府肉鵝母系卵泡顆粒細(xì)胞層為材料，選取常用的10個(gè)內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)獲取內(nèi)參基因 的Cq值 ，采用 ΔCT法[11]、qbase+[12]、NormFinder[13]、BestKeeper[14]4種方法評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期獲得在不同階段顆粒細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為后續(xù)相關(guān)研究中內(nèi)參基因的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的天府肉鵝母系來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場(chǎng)。本試驗(yàn)選用3只健康的、開產(chǎn)時(shí)間和體質(zhì)量基本一致，處于產(chǎn)蛋高峰期的天府肉鵝母系母鵝。放血處死后，迅速取出整個(gè)卵巢，分離出不同直徑大小的卵泡，用游標(biāo)卡尺測(cè)量不同卵泡橫軸直徑后，參照GILBERT等[15]所述方法分離不同階段（2～4 mm、4～6 mm、6～8 mm、8～10 mm、F5、F4、F3、F2、F1）卵泡顆粒細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）漂洗3～4次，剪碎后置于－80℃冰箱中凍存，備用。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用RNAiso Plus（TaKaRa公司，日本）提取鵝卵泡顆粒層組織總RNA，利用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按照RR047A型PrimeScriptTM（TaKaRa公司，日本）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于－20℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)[16-22]報(bào)道，選擇GAPDH、ACTB、TUB、HMBS、HPRT1、UBC、TBP、SDH、18S、28S等10個(gè)常用內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，候選內(nèi)參基因的引物信息見表1。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，將cDNA模板按10倍濃度梯度稀釋為7個(gè)濃度后，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，以獲取10個(gè)內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率。

表1 候選內(nèi)參基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上采用兩步法進(jìn)行。RT-qPCR使用25 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），cDNA模板 2.0 μL。RT-qPCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火、延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為55～95℃，每5 s增加0.5℃，以檢測(cè)引物特異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過CFX-Manager 3.1軟件獲得各個(gè)樣本的Cq值。根據(jù)公式Q＝EΔCT，其中，ΔCT＝CTmin－CT樣品，E為基因擴(kuò)增效率，利用Excel 2013計(jì)算出每個(gè)擴(kuò)增樣品的表達(dá)量Q。采用 ΔCT、qbase+（geNorm）、NormFinder、BestKeeper等方法綜合評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。由于每種方法基于不同的算法，使得所得到的結(jié)果可能會(huì)有差異，為了避免使用單一評(píng)價(jià)方法的片面性，因此可綜合使用多種評(píng)價(jià)方法[23]。本研究對(duì)4種分析方法所得到的評(píng)價(jià)排名取幾何均數(shù)，以最終的綜合排名指數(shù)來判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，該指數(shù)越小，則內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物特異性檢測(cè)

RT-qPCR熔解曲線分析結(jié)果如圖1所示，普通PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，引物擴(kuò)增片段單一，熔解曲線除主峰外沒有其他雜峰，說明無引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，所用內(nèi)參基因引物均為特異性擴(kuò)增。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過計(jì)算得知，10個(gè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率范圍為82.10%～108.68%，決定系數(shù)R2變化范圍為0.981～0.999（表2），表明各內(nèi)參基因在系列稀釋的濃度梯度內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 內(nèi)參基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)豐度分析

Cq值與基因的表達(dá)量呈反比，Cq值越大，基因的表達(dá)量越低；反之，Cq值越小，基因的表達(dá)量越高。圖3顯示，10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同階段顆粒細(xì)胞中表達(dá)的Cq值在10～29之間，其中SDH和TBP的表達(dá)量較低，而18S、28S的表達(dá)量均較高。

圖1 候選內(nèi)參基因的RT-qPCR熔解曲線Fig.1 RT-qPCR melting curves of candidate reference genes

2.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

利用ΔCT法和qbase+、NormFinder、BestKeeper 3個(gè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因在9個(gè)不同階段顆粒細(xì)胞中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。ΔCT法是通過計(jì)算各基因的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）來確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，基因穩(wěn)定性越高，故最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镠MBS。qbase+（geNorm）可計(jì)算各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M），M越小，基因穩(wěn)定性越高。NormFinder與geNorm程序相似，也是根據(jù)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值（M）大小來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。根據(jù)M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定的原則，qbase+和NormFinder 2種方法得到的最穩(wěn)定內(nèi)參基因均為SDH。BestKeeper通過計(jì)算每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r），以標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）和變異系數(shù)（CV）來判斷基因表達(dá)的穩(wěn)定性，相關(guān)系數(shù)越大，s和CV的值越小，表明基因表達(dá)越穩(wěn)定，當(dāng)s＞1時(shí)，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定，故最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)?8S。用4種方法對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析所得到的結(jié)果不盡相同，因此需要對(duì)4種方法得到的結(jié)果進(jìn)行綜合排序。對(duì)每一個(gè)內(nèi)參基因采用4種方法所得到的排名取幾何均數(shù)，得到最終的排名，結(jié)果見表3。在不同階段顆粒細(xì)胞中，最穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因依次為SDH、HMBS、18S，而穩(wěn)定性最差的3個(gè)內(nèi)參基因?yàn)閁BC、GAPDH、TUB。

圖2 內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of reference genes

表2 候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of candidate reference genes

圖3 候選內(nèi)參基因在顆粒細(xì)胞中的Cq值Fig.3 Cqvalues for candidate reference genes in granulosa cell

圖4 基于不同方法的內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析結(jié)果Fig.4 Reference gene expression stability analysis by ΔCT(A),qbase+(B),NormFinder(C),BestKeeper(D)

表3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性綜合排序Table 3 Comprehensive ranking of reference gene expression stability

2.5 最佳內(nèi)參基因數(shù)目的確定

在qbase+中的geNorm程序還可利用標(biāo)準(zhǔn)化因子進(jìn)行配對(duì)差異分析來評(píng)定所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。V值為引入1個(gè)新的內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異值（pairwise variation），當(dāng)Vn/Vn+1＜0.15時(shí)，不再需要引入下一個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正，則最佳內(nèi)參基因數(shù)為n個(gè)；而當(dāng)Vn/Vn+1＞0.15時(shí)，需要引入下一個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正，則最佳內(nèi)參基因數(shù)為n+1個(gè)。由圖5可以看出，V2/V3＜0.15，不需要引入第3個(gè)內(nèi)參基因，因此在不同階段顆粒細(xì)胞中的最佳內(nèi)參基因數(shù)為2個(gè)，結(jié)合以上內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的結(jié)果，在不同階段顆粒細(xì)胞中，可使用HMBS和SDH作為內(nèi)參基因，同時(shí)可根據(jù)二者的校正因子的幾何均數(shù)算出最適的校正因子。

2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

圖5 最佳內(nèi)參基因數(shù)目的確定Fig.5 Determination of the optimal number of reference genes

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選取最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因（SDH和HMBS）來分析FSHR基因在不同階段顆粒細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，同時(shí)選取表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因（UBC和GAPDH）作為對(duì)照。FSHR在禽類等級(jí)前卵泡活性維持及等級(jí)卵泡的選擇中起決定作用，F(xiàn)SHR在直徑為1～2 mm的卵泡顆粒層就已開始表達(dá)，在卵泡直徑為6～12 mm時(shí)表達(dá)量最高，而在等級(jí)卵泡顆粒層中逐漸降低[24-25]。圖6顯示，F(xiàn)SHR在鵝的顆粒細(xì)胞中表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，與使用GAPDH-UBC進(jìn)行校正相比，使用SDH-HMBS進(jìn)行校正得到的結(jié)果更符合FSHR的表達(dá)規(guī)律。在使用GAPDH-UBC進(jìn)行校正后，F(xiàn)SHR在8～10 mm的卵泡顆粒層中表達(dá)量顯著降低，而在F3、F1階段則顯著高于SDHHMBS的校正結(jié)果。

圖6 FSHR在不同階段顆粒細(xì)胞中的表達(dá)分析Fig.6 Relative expression of FSHR in different periods of granulosa cells

3 討論

內(nèi)參基因是指其表達(dá)水平不受研究條件的影響，且可以在多種組織和細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的基因。但內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)是相對(duì)的，內(nèi)參基因的表達(dá)因物種、組織、細(xì)胞、階段和研究條件的不同而變化[26]。目前，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)主要通過geNorm、NormFinder、BestKeeper等系列軟件計(jì)算出相關(guān)參數(shù)來進(jìn)行，并根據(jù)穩(wěn)定性高低進(jìn)行排序。VANDESOMPELE等[12]于2002年編寫出一款基于Excel的geNorm程序，這是一款專門用于RT-qPCR分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件，作為第一個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件，在內(nèi)參基因的評(píng)價(jià)和篩選方面起到了重要作用，是目前使用較廣的內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)軟件[27]。鑒于內(nèi)參基因穩(wěn)定性對(duì)RT-qPCR結(jié)果的重要性，后續(xù)又開發(fā)出了NormFinder、BestKeeper、ΔCT等多種方法，而這些評(píng)價(jià)方法均是通過不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來評(píng)定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的，由于每種軟件的算法不同，可能導(dǎo)致用不同方法得到的內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果不盡相同[23]。為了避免使用單一方法評(píng)價(jià)造成的片面性，因此可綜合使用多種評(píng)價(jià)方法，對(duì)多種分析方法得到的評(píng)價(jià)排名取幾何均數(shù)，以最終的綜合排名指數(shù)來評(píng)定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，該指數(shù)越小，則該內(nèi)參基因越穩(wěn)定[28]。本研究采用4種方法分析了10個(gè)內(nèi)參基因在9個(gè)不同階段顆粒細(xì)胞中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在不同階段顆粒細(xì)胞中，最穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因依次為SDH、HMBS、18S，而穩(wěn)定性最差的3個(gè)內(nèi)參基因依次為UBC、GAPDH、TUB。在獲得內(nèi)參基因的穩(wěn)定性之后，進(jìn)一步利用geNorm程序計(jì)算出在不同階段顆粒細(xì)胞中最佳內(nèi)參基因數(shù)為2個(gè)，并確定SDH和HMBS為最佳內(nèi)參基因組合。

GAPDH作為在多個(gè)物種和組織中被廣泛使用的內(nèi)參基因之一，其穩(wěn)定性相對(duì)較好，然而在禽類不同組織和階段中的表達(dá)具有較大差異性。JI等[29]對(duì)籽鵝5個(gè)組織在5個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期做了內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)28S、ACTB、HPRT1分別在心、腎、肌肉中表達(dá)最穩(wěn)定，而GAPDH在肝和卵巢中表達(dá)最穩(wěn)定。袁振杰等[30]對(duì)濟(jì)寧百日雞性腺軸在生長(zhǎng)階段中6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)參基因選擇進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)下丘腦中表達(dá)最為穩(wěn)定的是GAPDH，而在卵巢中表達(dá)最為穩(wěn)定的是ACTB。計(jì)紅等[31]研究了籽鵝產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期組織內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)GAPDH在產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期均較為穩(wěn)定，而18S在產(chǎn)蛋期較為穩(wěn)定，在產(chǎn)蛋前期穩(wěn)定性較差。前期研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH在不同階段顆粒細(xì)胞中表達(dá)不穩(wěn)定，GAPDH在等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)高于等級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞，而GAPDH是糖異生、糖酵解中的關(guān)鍵基因，可能是由等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞處在快速增殖過程中，細(xì)胞消耗的能量增加，GAPDH表達(dá)水平上調(diào)所致。SDH為琥珀酸脫氫酶控制基因，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。HMBS為羥甲基膽素合成酶控制基因，主要參與血紅素合成、卟啉代謝、轉(zhuǎn)移酶激活等過程。NASCIMENTO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HMBS和HPRT1在雞的胸肌中表達(dá)最穩(wěn)定，而TRFC和B2M的穩(wěn)定性最差。SAMIULLAH等[32]研究了產(chǎn)蛋母雞蛋殼形成過程中不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)HMBS和HPRT1在蛋殼形成不同時(shí)間點(diǎn)中表達(dá)最穩(wěn)定。ZHANG等[33]對(duì)黃羽肉雞的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)RPL13、GAPDH分別為肝和空腸中最佳內(nèi)參基因，HMBS為所有組織中表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本研究以篩選出來的SDH和HMBS為內(nèi)參基因，所計(jì)算出的FSHR的表達(dá)量更為準(zhǔn)確，由此可見，在鵝卵泡不同階段顆粒細(xì)胞中，以SDH和HMBS為內(nèi)參基因是合適的，而篩選出來的SDH和HMBS在不同階段顆粒細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)也是相對(duì)的，還與鵝的生長(zhǎng)日齡、產(chǎn)蛋狀況、生理狀態(tài)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究綜合4種內(nèi)參穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法，成功從10個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選出了在不同階段顆粒細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的2個(gè)內(nèi)參基因SDH、HMBS，以最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化校正因子可得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。