祝雙華 廖延 姜美花 詹宇婷 彭朝權(quán)

【摘要】目的探討心肌梗死后periostin對心功能的影響及其是否通過調(diào)控中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用，為臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。方法分別取正常野生型（WT）和periostin敲除（periostin^-/-）C57小鼠各60只，通過心臟左前降支永久結(jié)扎的方式制備心肌梗死模型，在心肌梗死前及心肌梗死后3周檢測2組小鼠心功能指標(biāo)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測組織形態(tài)學(xué)變化，并記錄2組小鼠生存情況;在心肌梗死后第1、3日通過流式方式檢測2組小鼠心肌梗死區(qū)中性粒細(xì)胞聚集情況。結(jié)果心臟彩色多普勒超聲顯示心肌梗死前2組小鼠的LVEF、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、左心室收縮末容積（LVESV）、左心室舒張末容積（LVEDV）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），而心肌梗死后3周periostin^-/-f LVEF及LVFS高于WT組（P均<0.01），LVESV及LVEDV均低于WT組（P均<0.05）。TTC染色示periostin^-/-組梗死灶面積較WT組更?。╰=5.817、P<0.05）。Periostin子組的生存率高于WT組（log-rank P=0.046）。流式結(jié)果顯示心肌梗死后第1日periostin'組心肌梗死區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量多于WT組（t=5.365，P<0.01），但在第3日少于WT組（t=2.548、P<0.05）。結(jié)論心肌梗死后periostin可以抑制中性粒細(xì)胞進(jìn)人梗死區(qū)清除壞死心肌，不利于后續(xù)心臟的修復(fù)以及心功能的改善。

【關(guān)鍵詞】心肌梗死;Periostin;中性粒細(xì)胞;心肌修復(fù)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┳鳛槟壳岸喟l(fā)、常見的心臟疾病，已然成為人類健康的一個(gè)重要負(fù)擔(dān)。其中，AMI最為兇險(xiǎn)，致死致殘率最高，并呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢[1-2]。高血壓病、糖尿病、抽煙、過度飲酒等均為冠心病的高危因素[3-4]。雖然藥物和介人治療很大程度降低了心肌梗死的致死率，但是在心肌梗死后，冠狀動(dòng)脈血流的急劇減少和（或）中斷使得該動(dòng)脈供應(yīng)的心肌組織嚴(yán)重缺血缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的大量壞死，最終引起心力衰竭等嚴(yán)重后果[5-7]。壞死的心肌組織促使免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制的啟動(dòng)，大量免疫細(xì)胞向梗死區(qū)聚集，以清除壞死細(xì)胞[8-9]。

Periostin是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，有研究表明，其與風(fēng)濕病、哮喘、腫瘤等多種疾病有關(guān)，在正常組織中沒有明顯表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)組織損傷特別是炎癥細(xì)胞聚集時(shí)表達(dá)量明顯升高[10-12]。心肌梗死早期發(fā)生急性炎癥反應(yīng)加重了心臟組織的缺氧損傷使梗死灶面積進(jìn)一步擴(kuò)大，然而，越來越多研究顯示心肌梗死早期伴隨的急性炎癥反應(yīng)可促進(jìn)壞死心肌細(xì)胞的清除，有利于后期心臟組織修復(fù)[13-16]。有研究顯示，心肌梗死早期發(fā)生的急性炎癥反應(yīng)伴隨大量炎癥細(xì)胞聚集，中性粒細(xì)胞作為早期炎癥反應(yīng)中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，在心肌梗死后第1日數(shù)量便達(dá)到高峰，隨之逐漸減少[17]。而periostin蛋白在心肌梗死后的炎癥反應(yīng)中所扮演的角色尚不清楚。本研究通過構(gòu)建periostin基因敲除（perios^-/-）C57小鼠和正常野生型（WT）C57小鼠AMI模型，探討periostin的有無對于心肌梗死后中性粒細(xì)胞聚集及心功能改變的影響，為心肌梗死后的藥物治療提供一定理論依據(jù)。

材料與方法

一、AMI小鼠模型的制備

1.Periostiri'-小鼠雜交、鑒定

無特定病原體（SPF）periostin基因敲除親代C57小鼠購自廈門大學(xué)，實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理。將periostin敲除雜合雌鼠與雜合雄鼠雜交，待子代生長至10～14d，剪取小鼠爪，按照組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）說明書提取genome DNA、并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：ddH₂O2.1μ1、2×Mix 6μl、WT下游引物0.3μl、periostin下游引物0.3 wl、WT及periostin上游引物0.3μl、cDNA 2μl，引物序列見表1。擴(kuò)增后利用1%瓊脂糖凝膠電泳，135V/h，軟件分析條帶位置。

2.AMI小鼠模型

分次選取SPF級12周齡正常野生型（WT組）（購自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）和periostin敲除（periostin^-/-組）C57小鼠，每次每組各20只（分別用于生存率分析及流式檢測、免疫熒光等），體質(zhì)量25～30g，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮、氣管插管、小鼠呼吸機(jī)正壓通氣，于左側(cè)第3、4肋間位置依次剪開皮膚、肌肉及肋間隙，暴露心臟，于左前降支起始端下2一3mm處進(jìn)行永久性結(jié)扎，可見結(jié)扎處以下左室前壁明顯變白，造模成功，關(guān)閉胸腔，等待小鼠麻醉蘇醒。

二、流式檢測中性粒細(xì)胞表達(dá)

心肌梗死后第0、1、3日取Wr組及periostin}.組小鼠各6只，麻醉后取心臟組織用HBSS沖洗，剪取梗死區(qū)稱重后，加入11型膠原酶、DNase I，用組織細(xì)胞勻漿儀制備成細(xì)胞懸液，離心棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入小鼠流式抗體CDllb-PEcy7 （1：20）（Thermo）、 Lineage-FITC（1：20）（Thermo），4℃避光孵育30min、PBS清洗、離心、重懸后，流式細(xì)胞儀檢測CDllb及Lineage雙陽性細(xì)胞群[18]。0

三、冰凍切片及免疫熒光染色

心肌梗死后第1、3日取2組小鼠各3只，麻醉、灌注固定后取出心臟，4%多聚甲醛4'C固定12h，30%蔗糖脫水過夜，OCT包埋組織，置于一20℃冰凍切片機(jī)至包埋劑凝固后連續(xù)冰凍切片（厚度為6μm），復(fù)溫后用PBS漂洗，山羊血清封閉40min，Ly6g（1：250，BD公司）一抗4℃孵育過夜，PBS充分漂洗，熒光二抗（488抗rat1：500，Thermo）室溫孵育30min，PBS充分漂洗，DAPI染核2min，PBS充分漂洗，封片，共聚焦顯微鏡（LSM800）觀察拍照。

四、組織RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）

心臟組織剪碎，加入小鋼珠和1ml Trizol，組織勻漿振蕩器研磨后，加入200μl氯仿，充分振蕩混勻15s，室溫靜置10min，4℃ 12000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上層水相，加入等量異丙醇，充分混勻，室溫10min，4℃12000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清，75%乙醇4℃8500轉(zhuǎn)/分離心5min、室溫干燥10min、DEPC水溶解，測定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN）合成cDNA，進(jìn)行qPCR、反應(yīng)體系：cDNA 3μl、DEPC水3.6μl、2×Mi×7.5μl、上下游引物各0.3μl，引物序列見表2。程序如下：94℃預(yù)變性5min，循環(huán)程序94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，并收集熒光信號，共40循環(huán)。

五、TTC染色

小鼠麻醉后取出心臟，清除黏連組織及血液，直接放入-20℃速凍20～30min，用刀片從心尖開始手動(dòng)切厚度約1mm的切片，放入提前預(yù)熱好的TTC孵育液中，37℃避光孵育30min，間隔10min輕搖組織，使其染色均勻，組織顯色后加人終止液后進(jìn)行拍照，正常組織呈紅色，梗死區(qū)呈蒼白色，計(jì)算梗死比例=（單個(gè)層面梗死區(qū)面積X厚度）/（單個(gè)層面梗死區(qū)與非梗死區(qū)總面積X厚度）。

六、心功能檢測

正常小鼠及心肌梗死后3周用小鼠超聲機(jī)檢測LVEF、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、左心室收縮末容積（LVESV）、左心室舒張末容積（LVEDV）。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、Graphpad、Image J進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以x±s表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用log-rank檢驗(yàn)對比生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Periostiri'-小鼠鑒定

本研究采用雜合型periostin敲除雌雄鼠交配獲得子代小鼠，通過瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定子代小鼠基因型。WT鼠顯示一條帶，條帶位置691bp;純合子顯示一條帶，條帶位置500by;雜合子顯示兩條帶，條帶位置500 by和691by，見圖1A。此外，為明確純合小鼠是否表達(dá)periostin、RT-PCR結(jié)果顯示在心肌梗死后第1、3日，periostin^-/-小鼠都不表達(dá)periostin，見圖1B。

二、Periostin敲除可改善心肌梗死小鼠左心功能。

為了排除periostin蛋白本身對心功能的影響，本研究比較了心肌梗死前periostin^-/--小鼠和WT小鼠的心功能差異。WT組和periostin^-/--組的LVEF、LVFS、LVESV、LVEDV比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。而在心肌梗死后第3周心臟彩超顯示，periostin^-/-組與WT組比較，LVEF（t=7.689、P=0.005）、LVFS（t=8.366，P=0.004）升高，而LVESV（t=3.538，P=0.038）及LVEDV（t=6.366，P=0.024）則降低，見圖2。

三、Periostin敲除可縮小心肌梗死后的梗死灶面積

本研究采用TTC染色反映心肌梗死小鼠梗死灶面積，結(jié)果表明心肌梗死后3周，periostin^-/-組梗死灶面積小于WT組（t=5.817，P=0.004），見圖3。

四、Periostin敲除可提高心肌梗死后小鼠生存率

雖然periostin^-/-組與WT組相比確實(shí)改善了各項(xiàng)心功能指標(biāo)，也確實(shí)縮小了梗死灶面積，但是其對小鼠心肌梗死后心功能的改善程度是否具有臨床轉(zhuǎn)化意義并不清楚。因此本研究進(jìn)一步比較了periostin^-/--小鼠與WT小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。以心肌梗死后21d作為觀察終點(diǎn)，通過生存曲線分析（log-rank檢驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)periostin^-/-組的生存率要高于WT組（P<0.05），見圖4。

五、Periostin可抑制心肌梗死早期梗死灶中性粒細(xì)胞浸潤

心肌梗死早期急性炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，因此本研究為了探究periostin在心肌梗死早期的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用，利用流式細(xì)胞方法檢測心肌梗死后第0、1、3日的periostin^-/-組以及WT組梗死灶的中性粒細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，心肌梗死后第1日periostin^-/-組梗死區(qū)的中性粒細(xì)胞多于wlr組（t=5.365、P=0.003）o而在第3日periostin組梗死區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而且要少于WT組（t=2.548，P=0.034），見圖5。免疫熒光結(jié)果與流式結(jié)果一致，見圖60

六、Periostin敲除可提高梗死區(qū)炎癥因子表達(dá)

periostin^-/-組與WT組細(xì)胞相比，心肌梗死后第1日的IL-1β（t=22.940，P < 0.001）、TNF-α（t=12.990，P<0.001）、IL-8（t=11.800，P<0.001）、IL-23α（t=7.027，P<0.001）升高，第3日2組IL-1β、TNF-α、IL-8雖無明顯差異，但periostin^-/-組較第1日下降明顯，并且periostin^-/--組的IL-23α（t=4.931，P=0.001）仍高于WT組，見圖70其中IL-1β、TNF-α和IL-8均可以招募中性粒細(xì)胞，IL-23 a則招募巨噬細(xì)胞。因此，心肌梗死早期的缺氧損傷可能引起心肌梗死區(qū)固有免疫細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)上升，將中性粒細(xì)胞趨化至梗死區(qū)發(fā)揮效應(yīng)。

討論

本研究發(fā)現(xiàn)，periostin^-/--組比WT組小鼠在心肌梗死后3周的心功能提高，梗死灶面積縮小，且小鼠的生存率更高。periostin^-/-小鼠心肌梗死后第1日梗死灶內(nèi)浸潤的中性粒細(xì)胞比WT /J"鼠更多。然而第3日WT組小鼠梗死灶內(nèi)的中性粒細(xì)胞反而多于periostin^-/--組。此外，心肌梗死后第1日periostin^-/-組小鼠比WT組的IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-23α表達(dá)增加。以上結(jié)果提示，心肌梗死發(fā)生后periostin蛋白通過抑制可趨化中性粒細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)從而降低梗死灶內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量，使得心肌梗死后早期壞死心肌細(xì)胞清除、心肌修復(fù)受阻，梗死灶面積不縮小，進(jìn)而使得心功能下降，小鼠生存率降低。

心肌梗死早期血流中斷導(dǎo)致梗死區(qū)心肌細(xì)胞缺氧損傷壞死引起急性炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)釋放增加，炎癥細(xì)胞聚集至梗死區(qū)，此時(shí)進(jìn)人梗死區(qū)的主要為中性粒細(xì)胞以及促炎型巨噬細(xì)胞[5，17-18]。本結(jié)果也證實(shí)無論是periostin^-/-組還是WT組小鼠心肌梗死后第1日梗死灶浸潤的中性粒細(xì)胞急劇升高。但是與其他研究不同的是，心肌梗死后第3日梗死區(qū)內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量比第1日明顯下降。主流觀點(diǎn)認(rèn)為心肌梗死早期炎癥反應(yīng)雖然清除了一部分壞死心肌，但是在此過程中產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞毒性物質(zhì)對梗死灶內(nèi)存活的心肌細(xì)胞甚至鄰近梗死區(qū)的正常心肌細(xì)胞也發(fā)揮了殺傷作用[19]。因?yàn)樾募∫话惚徽J(rèn)為是不可再生的，所以心肌細(xì)胞在心肌梗死后發(fā)生的是瘢痕修復(fù)。但是心肌組織發(fā)揮生理功能依賴于心肌細(xì)胞而非瘢痕組織，況且心肌梗死早期炎癥反應(yīng)使得心肌細(xì)胞受到更嚴(yán)重?fù)p傷甚至炎性壞死。因此，大部分學(xué)者認(rèn)為心肌梗死早期炎癥反應(yīng)不利于梗死后心臟修復(fù)，并且提出利用一些拮抗早期炎癥反應(yīng)的藥物治療心肌梗死[9]。然而與其他研究不同，本研究發(fā)現(xiàn)periostin^-/-組在心肌梗死后第1日梗死區(qū)中性粒細(xì)胞上升而第3日下降，并且可改善小鼠預(yù)后。我們認(rèn)為periostin蛋白缺失后，中性粒細(xì)胞在心肌梗死后第1日的時(shí)候急劇升高以便快速清除壞死細(xì)胞，在第3日的時(shí)候迅速降低以控制炎癥的強(qiáng)度、時(shí)間、范圍，盡量減少對存活心肌細(xì)胞及梗死灶鄰近區(qū)正常心肌的殺傷作用，同時(shí)快速啟動(dòng)組織修復(fù)的過程。而且?guī)醉?xiàng)拮抗早期炎癥反應(yīng)的藥物臨床試驗(yàn)均告以失敗，也從側(cè)面反應(yīng)了早期炎癥對心肌梗死后組織修復(fù)并不是不利的[20-22]。

綜上所述，本研究采用periostin^-/-小鼠和WT小鼠建立AMI模型，直接清除periostin蛋白觀察動(dòng)物表型，避免了因?yàn)榈鞍妆镜妆磉_(dá)掩蓋的現(xiàn)象。從建立AMI模型之后小鼠的心功能、心臟病理改變、生存預(yù)后等多方面揭示periostin^-/--心肌梗死小鼠表型的改變，結(jié)合已有研究推陳出新，得到了與以往研究不同的結(jié)論，并且初步探討了periostin^-/-改善心肌梗死小鼠預(yù)后的機(jī)制。本研究的不足之處在于對于機(jī)制探索過于淺顯，僅僅發(fā)現(xiàn)了periostin^-/-小鼠心肌梗死后第1日炎癥介質(zhì)將大量中性粒細(xì)胞招募至梗死區(qū)，但第3日中性粒細(xì)胞卻急劇下降的原因沒有找到，并且中性粒細(xì)胞通過何種途徑清除壞死心肌細(xì)胞同時(shí)盡量減少對存活心肌細(xì)胞的殺傷并不明確。未來可從本研究出發(fā)，深入探索急性炎癥反應(yīng)在心肌梗死早期心臟修復(fù)方面的分子機(jī)制，趨利避害為改善AMI的臨床治療及預(yù)后提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.009

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81370214）;廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313183）

作者單位：510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科（祝雙華，彭朝權(quán)）;510060 廣州，中山大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究中心

（廖延，姜美花）;510800廣州，中山大學(xué)附屬腫瘤防治中心（詹宇婷）

通信作者，彭朝權(quán)，E-mail：pengcq123456@163.com