陳盛鐿　朱少平　胡利　謝作鋼

【摘要】 目的探討桂枝茯苓丸對慢性非細菌性前列腺炎（ CNP）大鼠模型的治療作用，探討其可能機制。方法將15只雄性SD大鼠分為生理鹽水組、模型組和藥物治療組，每組各5只。適應性飼養(yǎng)后，生理鹽水組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl生理鹽水注射。模型組及藥物治療組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl的5%甲醛溶液注射誘導前列腺炎癥，藥物治療組在誘發(fā)前列腺炎前2d開始以0.5 9/（kg·d）的桂枝茯苓丸懸液灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d后進行膀胱測壓，測壓后采集大鼠的膀胱和前列腺組織，使用實時熒光定量PCR法檢測神經(jīng)生長因子（NCF）、三磷酸腺苷受體（ P2X2）、瞬時受體電位通道Al（ TRPAI）、TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧酶2（ COX2）和雌激素受體（ER） mRNA的相對表達并進行組織學分析。結(jié)果 與生理鹽水組大鼠相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少（P均> 0.05），藥物治療組大鼠上述指標均較模型組改善（P均<0.05）。模型組大鼠的前列腺組織可見肥大細胞和淋巴細胞的基質(zhì)浸潤和不規(guī)則形狀的腺泡，藥物治療組大鼠的前列腺組織中未見上述改變。與生理鹽水組相比，模型組大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPAI以及前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2的mRNA相對表達均較高（P均<0.05）;而藥物治療組上述mRNA相對表達均低于模型組（P均<0.05）。模型組大鼠ER β mRNA相對表達、ERβ /ERα低于生理鹽水組，ERα mRNA相對表達高于生理鹽水組（P均<0.05）;而藥物治療組大鼠ERβmRNA相對表達、ERβ /ERα高于模型組，ERα mRNA相對表達低于模型組（P均<0.05）。大鼠上皮細胞核和前列腺腹葉細胞ERB染色在生理鹽水組中呈陽性，在模型組中染色減弱，在藥物治療組中亦呈陽性。結(jié)論桂枝茯苓丸可能通過激活ERβ，使前列腺的ERβ /ERα的表達比升高，改善前列腺炎癥及CNP刺激性膀胱過度活動。

【關鍵詞】 前列腺;炎癥;雌激素受體;桂枝茯苓丸

前列腺炎分為急性和慢性前列腺炎，慢性非細菌性前列腺炎（CNP）是前列腺炎中最常見的類型，占慢性前列腺炎的90%以上[1]。據(jù)報道，非細菌性前列腺炎與BPH和男性下尿路癥狀（IUTS）的發(fā)展有關[2]。研究顯示，前列腺活組織檢查（活檢）標本中BPH體積和國際前列腺癥狀評分（IPSS）有關，且嚴重的炎癥與高IPSS相關[3-4]。前列腺炎癥可能是BPH和男性LUTS的重要病因之一。另有研究顯示，雌激素通過2種不同的雌激素受體（ ER）即ERα和ERβ調(diào)節(jié)組織炎癥[5]。ERβ的抗炎作用也在各種動物疾病模型中發(fā)揮作用，如腦脊髓炎、炎癥性腸病、膀胱炎和皮膚病。桂枝茯苓丸源于張仲景《金匱要略·婦人妊娠病脈并治》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，原為針對妊娠期婦女化淤的方劑。近年研究顯示，其應用己不限于婦科疾病，對治療CNP同樣有效[6]。因此，本研究利用前列腺內(nèi)注射甲醛誘導CNP大鼠模型來研究桂枝茯苓丸是否可以通過調(diào)節(jié)ERβ減輕膀胱過度活動，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠15只，8周齡，體質(zhì)量200 - 250g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供[實驗動物許可證SCXK（浙）2015-0001]，于恒定室溫下，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中自適應飼養(yǎng)7d，期間自由攝食與飲水。本研究所有的實驗操作均符合中國實驗動物管理規(guī)定，研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學實驗動物管理和倫理委員會批準。

二、主要試劑及儀器

主要試劑包括：桂枝茯苓丸（成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司），DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），S-P免疫組織化學染色（免疫組化）檢測試劑（北京中杉金橋公司）。主要儀器包括：Leica CM2500顯微成像系統(tǒng)，OlympusCX21顯微鏡，SHIMADZU電子分析天平（萬分一），萊卡石蠟切片機，勻漿器（江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠），旋渦混合器（北京北德科學器材有限公司），Hitachi-CR2082高速冷凍離心機，GZX-9070電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

三、方法

1.分組

經(jīng)過適應性飼養(yǎng)后將大鼠分生理鹽水組、模型組、藥物治療組，每組各5只。生理鹽水組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl生理鹽水注射。模型組及藥物治療組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl的5%甲醛溶液注射誘導前列腺炎癥[7]。藥物治療組大鼠從甲醛注射前2d開始，持續(xù)30 d予桂枝茯苓丸及生理鹽水制成的混懸液0.5 g/（kg.d）灌胃，模型組大鼠在相應時間予等體積生理鹽水灌胃。

2.膀胱測壓

在大鼠前列腺內(nèi)注射50μl 50%甲醛溶液或生理鹽水28 d后行膀胱測壓。測定前2d用異氟烷麻醉大鼠，將PE-50聚乙烯導管從膀胱壁插入膀胱中，并且在膀胱測壓當日將導管通過三通旋塞連接到壓力傳感器和注射泵上，以0.05 ml/min的速度將生理鹽水通過注射泵注入膀胱內(nèi)，并在Power-LabTM數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)上采集數(shù)據(jù)記錄膀胱內(nèi)壓。大鼠適應環(huán)境至少2h后，分別記錄3次排尿周期以評估排尿間隔（ VI）、最大排尿壓（MVP）和無排尿性收縮次數(shù)（ NVC）。在3次排尿循環(huán)之后，停止注射生理鹽水并撤回膀胱內(nèi)導管，隨后通過腹壁手動壓縮膀胱測量排空后殘余尿量（ RV）。

3.組織病理學檢查

膀胱測壓后，用頸椎脫臼法處死大鼠，下腹部正中切口，直達腹腔，取前列腺腹葉和膀胱組織進行組織學分析，用10%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木素一伊紅（HE）染色評估炎癥程度。前列腺的其余部分用于免疫組化。將石蠟切片脫蠟、梯度乙醇水化，在105℃下用高壓滅菌器以10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液修復抗原，冷卻后PBS沖洗，3%過氧化氫中孵育10 min消除過氧化物酶活性，蒸餾水和PBS沖洗。滴加10%正常山羊血清封閉30 min。滴加ERβ抗體在室溫下孵育1h。PBS洗滌，滴加HRP標記的聚合物抗兔抗體溫育30 min。PBS洗滌，用DAB顯色液顯色2-5 min，蘇木素復染。

4.實時熒光定量PCR

處死大鼠后打開腹腔，取前列腺腹側(cè)葉和一部分膀胱黏膜組織至新的1.5 ml EP管中，用玻璃棒研磨，加入Trizol l ml充分振蕩混勻，加入氯仿0.2 ml，蓋緊后用力搖15 s，15 - 30℃孵育2 -3 min，4℃12 000×g離心15 min，取上清液，根據(jù)說明書使用Trizol試劑提取總RNA;使用ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)將總RNA（l mg）合成為模板DNA。引物分別為ERβ（NM_012754）、ERa（NM_012689）、TNF-α（NM_012675）、 誘導型一氧化氮合酶（iNOS，XM_003750865）、環(huán)氧酶2（COX2，NM_017008）、三磷酸腺苷受體（P2X2，NM_207608）、瞬時受體電位通道A1（TRPAI，XM_008769306）、神經(jīng)生長因子（NGF，NM_001277055）和內(nèi)參基因GAPDH（ NM_017008）。其中引物ERB、ERα、TNF-α、COX2、NGF和GAPDH由QIAGEN（ QuantiTect Primers）預先設計和驗證，其他引物由Primer 3軟件設計（表1）。PCR反應體系50μl，反應條件為：94℃30 s、55℃30 s、72℃60 s，最后72℃延伸7 mm，共30個循環(huán)。SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因的表達并利用2-△△ CT法分析相應的數(shù)據(jù)，取每個靶基因與GAPDH的表達比值為相對表達的結(jié)果。

四、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、3組大鼠的膀胱測壓結(jié)果比較

在前列腺內(nèi)注射50 μl 5%甲醛溶液或生理鹽水28 d后3組大鼠的排尿間隔（F=23.895，P< 0.001）、每排尿周期無排尿性收縮次數(shù)（F=38.224，P<0.001）、最大排尿壓（F=24.629，P< 0.001）、殘余尿量（F=10.236，P=0.002）比較差異有統(tǒng)計學意義。與生理鹽水組大鼠相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少（P均> 0.05），藥物治療組大鼠上述指標均較模型組改善（P均< 0.05），見圖1。

二、3組大鼠的組織病理學比較

生理鹽水組大鼠前列腺組織的腹側(cè)葉中有規(guī)則形狀的腺泡和完整的基底膜（圖2A），模型組大鼠的前列腺組織可見肥大細胞和淋巴細胞的基質(zhì)浸潤和不規(guī)則形狀的腺泡（圖2B），然而，藥物治療組大鼠的前列腺組織中未見上述改變（圖2C）。3組大鼠的膀胱組織均無炎癥細胞積聚或上皮形成改變（圖2D-F）。

三、3組大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和IRPA1mRNA相對表達比較

生理鹽水組、模型組、藥物治療組大鼠膀胱黏膜中NGF（F=43.648，P<0.001）、P2X2（F= 37.017， P<0.001）和TRPAI （F= 34.572，P<0.001）的mRNA相對表達差異均有統(tǒng)計學意義，模型組大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPA1的mRNA相對表達均高于生理鹽水組（P均<0.05），藥物治療組大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPAI的mRNA相對表達均低于模型組（P均<0.05），見圖3。

四、3組大鼠前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ mRNA相對表達比較

3組大鼠前列腺腹葉中TNF-α（F=18.580，P<0.001）、iNOS（F=15.690，P<0.001）、COX2（F= 16.345，P=0.004）、ERa （F= 26.844，P<0.001）、ER3（F=20.657，P<0.001） mRNA相對表達和ERB /ERa（F=12.062，P=0.001）比較差異均有統(tǒng)計學意義。與生理鹽水組相比，模型組大鼠前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ的mRNA相對表達均較高（P均<0.05），而藥物治療組的上述基因mRNA相對表達均低于模型組（P<0.05）。模型組大鼠ER[3 mRNA相對表達低于生理鹽水組，ERα mRNA相對表達高于生理鹽水組（P均< 0.05），而藥物治療組大鼠ER3 mRNA相對表達、ER3/ERa高于模型組，ERα mRNA相對表達低于模型組（P均<0.05），見圖4。

五、3組大鼠的免疫組化

在生理鹽水組大鼠中，ERβ在上皮細胞核和前列腺組織腹葉的細胞質(zhì)中觀察到陽性染色（圖5A）。在模型組大鼠中，不規(guī)則形狀腺泡的上皮細胞核中ERβ染色減弱，前列腺腹葉中可見炎性改變（圖5B）。在藥物治療組大鼠中ER3表達恢復到生理鹽水組大鼠的水平（圖SC）。

討論

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，主藥桂枝辛甘而溫、溫通經(jīng)脈，以除淤滯，輔藥桃仁味苦甘平，活血化淤，丹皮、白芍味苦微寒，既能活血散淤，又可涼血以清淤熱，白芍兼能緩急止痛。茯苓甘淡性平，利水滲濕以祛痰，并能健脾益氣。該方寒溫并用，溫通祛淤而無耗傷陰血之弊，祛邪以固本，下淤不傷正。該藥原用于婦科，在子宮肌瘤和卵巢囊腫等有較好的治療效果，也有助女性調(diào)理月經(jīng)。近年多項研究顯示，其應用己不限于婦科疾病，凡辨證屬于血淤濕滯者的各科疾病，均可加減用之且有效，這也是中醫(yī)學中“異病同治”的治法和優(yōu)勢。有研究報道，桂枝茯苓丸可降低血清雌激素受體（ ER）水平，但存在研究的樣本尚少，未能闡明治療機制[8]。

CNP患者常表現(xiàn)出膀胱刺激癥狀，如尿頻或尿急[9]。本研究中，與生理鹽水組相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少，表明CNP大鼠存在膀胱過度活動。NGF是膀胱過度活動癥（ OAB）的生物標志物之一，其在患者的尿液中濃度很高[10]。本研究還檢測了P2X2和TRPAI受體的表達，這些主要在C纖維傳人途徑中表達的受體，已被認為是OAB或膀胱炎癥中的病理生理機制[11]。因此，本研究中上述基因相對表達在膀胱中的上調(diào)可能導致CNP后膀胱活動增強[12]。

在模型組大鼠中，前列腺組織中ERα和炎癥相關基因如TNF-α、iNOS和COX2上調(diào)。然而，用桂枝茯苓丸治療可減少膀胱過度活動和下調(diào)ERα、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA表達，并恢復ERβ的mRNA表達[13]。TNF-α是一種促炎細胞因子，由巨噬細胞響應組織損傷而產(chǎn)生，COX2和iNOS表達的上調(diào)誘導PGE2和NO的產(chǎn)生[14]。這些基因在組織炎癥進展中發(fā)揮重要作用。

雖然已知雌激素參與調(diào)節(jié)前列腺生長，但也對前列腺上皮有不良影響，如異常增生、炎癥和癌變等[15]。研究顯示雌激素對前列腺的這些作用與ERα的激活有關[15-16]。本研究使用大鼠CNP模型研究ERα和ERβ表達的變化，通過注射甲醛誘導大鼠前列腺炎，可觀察到ERα的mRNA表達增加，而ERβ的表達下調(diào)。因此，甲醛誘導的前列腺炎可能會增加ERα與ERβ的相對表達水平，進而可能導致慢性前列腺炎癥。一項BPH組織的研究也顯示，與正常前列腺組織相比，前列腺上皮細胞中ERα表達水平增加，表明ERα的激活是BPH相關增殖的重要機制[17]。

本研究未對前列腺炎癥表型進行定量分析，包括前列腺炎或桂枝茯苓丸治療后異常腺泡的發(fā)生率，而主要關注膀胱表型，如膀胱過度活動和前列腺炎癥后膀胱的分子變化。因此，需要進一步研究驗證ER介導的前列腺炎調(diào)節(jié)機制。

總之，炎癥相關基因表達的增加和ERβ/ERα的降低可能導致動物模型中CNP和膀胱過度活動的發(fā)生。而桂枝茯苓丸給藥治療可以升高ERβ/ERα，并抑制膀胱過度活動和前列腺炎癥。因此，ERβ刺激可能成為治療前列腺炎癥和BPH患者中刺激性膀胱癥的治療策略。

參考文獻

[l]陳盛鐿，朱少平，胡利，裘順安.柴芩通淋片對慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的作用及機制研究.中醫(yī)藥導報，2016，22（ 10）：13-17。

[2] 黃向華，覃斌，梁毅文，吳清國，李長贊，韋鋼山，季漢初，梁陽冰，陳紅秋，關挺，合并組織學前列腺炎的良性前列腺增生患者TURP手術(shù)對下尿路癥狀的影響.中華男科學雜志，2013，19（1）：35-39.

[3]龔云，王明秀，黃玉珠.Sa-還原酶抑制劑對前列腺癌內(nèi)分泌治療患者生活質(zhì)量的影響及護理分析，國際護理學雜志，2014， 33（9）：2570-2572.

[4] Andriole G，Bostwick D，Brawley 0，Gomella L，MarbergerM， Tindall D，Breed S，Somerville M，Rittmaster R;REDUCEStudy Group. Chemoprevention of prostate cancer in men at highrisk： rationale and design of the reduction by dutasteride ofprostate cancer events（ REDUCE） trial.J Urol， 2004. 172（4Ptl）：1314-1317.

[5]覃展偶，何書華，張?zhí)煊?，蔣雷鳴，劉升學，高漓，潘其壯.前列腺組織中ERa、ER B的表達及其意義，臨床與實驗病理學雜志，2010. 26（6）：701-703.

[6] 龍憲智，陳其華.加味桂枝茯苓丸治療Ⅲ型前列腺炎60例，中醫(yī)藥導報，2014. 20（ 4）：114-115.

[7]Funahashi Y. O'Malley KJ， Kawamorita N， Tyagi P，DeFr-anco DB， Takahashi R. Cotoh M， Wang Z，Yoshimura N.Upregulation of androgen-responsive genes and transforminggrowth factorB l cascade genes in a rat model of non-bacterialprostatic inflammation. Prostate， 2014. 74（4）：337-345.

[8] 陶雪峰，劉永俠，王亞琴，王艷艷，桂枝茯苓丸聯(lián)合米非司酮治療子宮肌瘤的療效及對患者血清孕激素受體、雌激素受體和血管內(nèi)皮生長因子的影響，藥物評價研究，2018. 41（4）：607-610.

[9] 張亞龍，高繼學，張燁，良性前列腺增生癥患者膀胱壁和逼尿肌厚度改變的相關研究進展.新醫(yī)學，2017. 48（ 10）：688-691.

[10] Liu HT. Chen CY. Kuo HC. Urinary nerve growth factor levelsin overactive bladder syndrome and lower urinary tract disorders.J Formos Med Assoc. 2010. 109（ 12）： 862-878.

[11]都書琪，吳偉力，張騫，孔垂?jié)?，瞬時受體電位蛋白通道A1在大鼠炎癥性膀胱感覺通路中不同部位的表達變化.中國醫(yī)科大學學報，2011. 40（9）：769-771.

[12] 唐偉.樹酯毒素抑制前列腺炎大鼠前列腺痛和不穩(wěn)定膀胱的實驗研究，重慶：第三軍醫(yī)大學，2007.

[13]Mizoguchi S，Mori K， Wang Z，Liu T，F(xiàn)unahashi Y. Sato F，DeFranco DB， Yoshimura N，Mimata H.Effects of estrogenreceptor β stimulation in a rat model of non-bacterial prostaticinflammation. Prostate. 2017. 77（7）：803-811.

[14]楊宇，周輝良，余鵬，關勝，陳志鵬，劉啟祥，曹林升，大鼠化學性前列腺炎的MIF. COX2. NGF實驗研究，中國男科學雜志，2012， 26 （6）：3-6.

[15] Risbridger GP， Wang H， Frydenberg M. Cunha G.Themetaplastic effects of estrogen on mouse prostate epitheliuru：proliferation of cells with basal cell phenotype. Endocrinology，2001， 142（ 6）： 2443-2450.

[16]覃展偶.雌激素受體亞型ERα、ERβ在前列腺組織中的表達及其意義.桂林：桂林醫(yī)學院，2013.

[17] Nicholson TM， Sehgal PD， Drew SA， Huang W， Ricke WA. Sexsteroid receptor expression and localization in benign prostatichyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation，2013. 85（4-5）：140-149.