呂強(qiáng)，劉宇，胡云霞，李美亭

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 麻醉科，四川 成都 610072）

肺缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）時，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，炎癥介質(zhì)釋放，活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成增加，引起細(xì)胞和組織損傷，甚至發(fā)生肺衰竭。

血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）表達(dá)增加是細(xì)胞應(yīng)激過程中最重要的保護(hù)機(jī)制之一。研究顯示，HO-1 表達(dá)增加可減輕肺IR 損傷及內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷[1-2]。HO-1 的保護(hù)作用與其抗氧化、維持微環(huán)境穩(wěn)定、抗炎癥反應(yīng)和抗凋亡有關(guān)[3]。

帕瑞昔布為特異性環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase 2,COX-2）抑制劑。ZHANG 等[4]在大鼠肝IR 時發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布預(yù)處理可抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激而減輕肝臟損傷。抑制COX-2 也可減輕腦、腎IR 損傷，以及骨骼肌IR 引起的肺損傷[5-7]。另外，COX-2特異性抑制劑還可經(jīng)過ROS 途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)HO-1[8]。帕瑞昔布能否減輕肺IR損傷；是否與肺組織內(nèi)HO-1 表達(dá)變化有關(guān)還不清楚。本研究用不同劑量帕瑞昔布處理肺IR，檢測肺內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和髓過氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、肺組織病理改變、凋亡程度及HO-1 表達(dá)情況，探討帕瑞昔布對肺IR 損傷的影響機(jī)制，以及是否與劑量相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

40 只無特定病原體（SPF）級健康雄性成年SD大鼠（280～300g），購于四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，動物許可證號：SCXKU1172013-15。MDA和MPO 試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司），HO-1 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型復(fù)制將大鼠隨機(jī)分為5 組（每組8 只）：對照組（C 組）、缺血再灌注組（IR 組）、帕瑞昔布低劑量組（L 組，2mg/kg）、帕瑞昔布中劑量組（M組，10mg/kg）及帕瑞昔布高劑量組（H 組，20mg/kg）。C 組僅游離出左側(cè)肺門，其余各組根據(jù)文獻(xiàn)[9]，復(fù)制大鼠單側(cè)肺IR 模型，IR 組單純阻斷左側(cè)肺門；L 組、M 組和H 組分別在阻斷左側(cè)肺門前15min，經(jīng)股靜脈注射帕瑞昔布2、10 及20mg/kg。實驗過程中，經(jīng)股靜脈給予C 組和IR 組大鼠等體積生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本收集左肺缺血60min，再灌注120min后，放血處死大鼠，立即取出左肺，剪為上、中、下3部分。

1.2.3 肺組織濕重/干重計算取出左肺上段組織后，立即稱量濕重，隨后放入80℃烘箱內(nèi)干燥48h，稱量干重，并計算濕重/干重。

1.2.4 MDA 及MPO 檢測取部分左肺中段組織勻漿，離心后吸取上清液，根據(jù)試劑盒操作指南分別檢測肺內(nèi)MDA 和MPO 含量。

1.2.5 觀察肺病理改變?nèi)∽蠓蜗露谓M織，用4%多聚甲醛固定3d。然后用石蠟包埋并切片，厚度10μm。經(jīng)HE 染色，并用光學(xué)顯微鏡觀察肺泡形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變及肺間質(zhì)水腫等變化。

1.2.6 肺組織凋亡細(xì)胞檢測根據(jù)TUNEL 凋亡試劑盒說明書操作完成后，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)讀取每張切片中的5 個視野，陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%即為凋亡指數(shù)（apoptotic index,AI）。

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測肺內(nèi)HO-1 mRNA 表達(dá)取左肺中段組織，用Trizol 試劑抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin 為內(nèi)參照，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60s，95℃變性15s，54℃退火20s，70℃延伸40s，40 個循環(huán)后，70℃延伸5min。根據(jù)每組RT-PCR 的Ct 值，用2-ΔΔCt計算目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。

表1 HO-1 及β-actin 引物序列

1.2.8 肺內(nèi)HO-1 蛋白檢測使用Western blotting檢測HO-1 蛋白質(zhì)含量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入HO-1 抗體（1 ∶1000 稀釋），置于4℃冰箱16h。漂洗后，加入β-actin 抗體（1 ∶10000 稀釋），室溫孵育1 h。滴加顯影液，采集圖像。圖像用Image J 軟件進(jìn)行分析，相對定量HO-1 蛋白表達(dá)豐度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，經(jīng)正態(tài)性檢驗，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕重/干重

各組濕重/干重值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與C 組比較，其余4 組濕重/干重值均升高（P＜0.05），其中IR 組升高最明顯，其次為L 組，而M 組和H 組升高最少（P＜0.05），且M 組和H 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 MDA 含量及MPO 活性

各組MDA 含量及MPO 活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與C 組比較，其余4 組肺內(nèi)MDA 含量升高，MPO 活性增強(qiáng)；IR 組MDA 含量及MPO 活性增加最多，L 組次之，M 組和H 組增加較少。除M組和H 組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 肺組織AI 情況

各組AI 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C 組肺組織中僅可見少量凋亡細(xì)胞，IR 組凋亡細(xì)胞增加，L組肺組織中凋亡細(xì)胞也增加，但較IR 組減少（P＜0.05），M 組和H 組凋亡細(xì)胞也增加，但較IR 組和L 組進(jìn)一步減少（P＜0.05）。見表2 和圖1。

2.4 肺組織病理改變

C 組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整；IR 組肺泡破壞嚴(yán)重，肺泡壁增厚明顯，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；L 組肺損傷較IR 組減輕，M 和H 組肺損傷較L 組進(jìn)一步改善，肺泡較完整，炎癥細(xì)胞浸潤減少。見圖2。

2.5 肺組織HO-1 表達(dá)水平

各組HO-1 mRNA 和蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C 組肺組織中HO-1 mRNA 和蛋白僅有少量表達(dá)，IR 組和L 組較C 組高（P＜0.05），M 組和H 組較L 組進(jìn)一步增加（P＜0.05）。H 組較M組HO-1 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.05），但HO-1 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組濕重/干重、MDA、MPO 及AI 比較 （n=8，±s）

表2 各組濕重/干重、MDA、MPO 及AI 比較 （n=8，±s）

注：1）與C 組比較，P＜0.05；2）與IR 組比較，P＜0.05；3）與L 組比較，P＜0.05

組別 濕重/干重 MDA/（nmol/mg） MPO/（u/g） AI/%C 組 4.29±0.40 1.60±0.15 1.71±0.16 2.14±0.60 IR 組 5.81±0.631） 3.65±0.351） 3.55±0.321） 31.17±3.581）L 組 5.41±0.321）2） 3.21±0.301）2） 2.98±0.251）2） 26.89±3.891）2）M 組 4.93±0.421）2）3） 2.39±0.281）2）3） 2.45±0.161）2）3） 18.16±3.641）2）3）H 組 4.84±0.291）2）3） 2.24±0.231）2）3） 2.30±0.251）2）3） 17.34±2.761）2）3）F 值 14.558 72.471 69.892 63.322 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組肺組織凋亡細(xì)胞 （TUNEL×400）

圖2 各組肺組織病理改變 （HE×200）

表3 各組肺組織HO-1 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 （n=8，±s）

表3 各組肺組織HO-1 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 （n=8，±s）

注：1）與C 組比較，P＜0.05；2）與IR 組比較，P＜0.05； 3）與L 組比較，P＜0.05；4）與M 組比較，P＜0.05

組別 HO-1 mRNA HO-1 蛋白C 組 0.14±0.01 0.13±0.01 IR 組 0.33±0.031） 0.31±0.031）L 組 0.37±0.031）2） 0.38±0.041）2）M 組 0.63±0.031）2）3） 0.47±0.031）2）3）H 組 0.68±0.051）2）3）4） 0.52±0.041）2）3）F 值 380.270 71.731 P 值 0.000 0.000

3 討論

肺IR 時，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、活化，引起肺組織炎性損傷；另外，ROS 生成增加，還可引起肺組織氧化損傷。該因素均可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮屏障受損，通透性升高，因此，肺IR 后，使得大量血漿成分滲出，容易出現(xiàn)肺間質(zhì)水腫。肺組織濕重/干重值可以間接反映液體滲出程度。MDA 為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，肺IR 時，肺組織中MDA 含量與氧自由基生成呈正相關(guān)[10]。在IR 肝損傷研究中發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2 抑制劑可降低MDA、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成[11]。MPO 主要存儲于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒內(nèi)，因此，肺組織中MPO 活性可間接反映肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺IR 后，肺組織濕重/干重值增加；MDA 含量和MPO 活性均升高。給予帕瑞昔布2 mg/kg可降低濕重/干重值，降低MDA 含量和MPO 活性；給予帕瑞昔布10 mg/kg，以上指標(biāo)降低更多；給予帕瑞昔布20 mg/kg，并未進(jìn)一步改善，表明帕瑞昔布可減輕IR引起的肺間質(zhì)水腫，減少中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，在一定程度上呈劑量依賴性。

本研究結(jié)果顯示，不同劑量帕瑞昔布預(yù)處理均可減輕IR 肺損傷，減少肺組織內(nèi)細(xì)胞凋亡。在IR 損傷、炎癥、應(yīng)激等情況下，多種因素促進(jìn)COX-2 表達(dá)增加，并在組織損傷過程中發(fā)揮作用，因此，阻斷COX-2 而具有抗炎特性[12]。同樣，在肺IR 時，肺內(nèi)COX-2 表達(dá)水平也上升[13]。在呼吸機(jī)誘導(dǎo)的肺損傷時，帕瑞昔布可減輕局部及全身炎癥反應(yīng)，降低肺泡上皮通透性、減輕肺間質(zhì)水腫；還可減少細(xì)胞凋亡[14]。所以，帕瑞昔布可能從多個環(huán)節(jié)減輕IR 肺損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布增加IR 肺組織內(nèi)HO-1表達(dá)；隨著帕瑞昔布劑量增加，HO-1 mRNA 逐漸增加，然而帕瑞昔布10 mg/kg 和帕瑞昔布20 mg/kg 處理后HO-1 蛋白并無變化。有研究顯示，使用高濃度特異性COX-2 抑制劑時，可能會失去選擇性，而同時抑制COX-1[15]。因此，大劑量帕瑞昔布，是否會通過COX-1 途徑在轉(zhuǎn)錄水平影響HO-1 表達(dá)還需進(jìn)一步研究。

HO-1 具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等特性。肺缺血后處理可通過增加HO-1 表達(dá)，而減輕肺IR 損傷[16]。HO-1 還能增強(qiáng)血管內(nèi)皮對抗補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷而發(fā)揮肺保護(hù)作用[17]。另外，HO-1 的肺保護(hù)功能可能還與其催化代謝產(chǎn)物一氧化碳和膽綠素有關(guān)。大鼠肺缺血損傷時，一氧化碳既可減少白細(xì)胞瘀滯、纖維蛋白聚集、改善氣體交換，提高存活率，又抑制肺內(nèi)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）活化、早期反應(yīng)蛋白-1 表達(dá)。因此減少組織因子、Serpine-1、白細(xì)胞介素-1 和TNF-α表達(dá)[18]。一氧化碳還可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，減少Caspase-3 活化，同時激活應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子[19]。膽綠素同樣也可以通過抗炎、抗凋亡和抗氧化作用保護(hù)缺血再灌注肺損傷[20]。

COX-2 抑制劑誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)可能是通過抑制COX-2 產(chǎn)生的。但在硝普鈉介導(dǎo)的細(xì)胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2 抑制劑誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)并不依賴于抑制COX-2[21]。因此，帕瑞昔布的具體機(jī)制介導(dǎo)缺血再灌注肺組織內(nèi)HO-1 的表達(dá)，還需要進(jìn)一步研究。

帕瑞昔布可減輕大鼠肺IR 后肺組織水腫程度，抑制脂質(zhì)過氧化；減輕IR 肺損傷，減少肺組織內(nèi)細(xì)胞凋亡，上述效應(yīng)在一定程度上呈劑量依賴性，并且可能與帕瑞昔布增加IR 肺組織中HO-1 表達(dá)有關(guān)。