孫源博，李桂芹，孫麗欣，王云楓，關利新，朱敏，贠捷

（牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院 1.腎內科，2.影像科，黑龍江 牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011；4.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 腎內科，黑龍江 哈爾濱 150040）

腎間質纖維化是終末期腎病的共同特點，在多種因素的作用下腎間質細胞增多，纖維蛋白合成增加，基質降解被抑制，細胞外基質大量堆積，嚴重損傷腎臟細胞和組織結構，導致腎功能降低、腎小管和腎小球的纖維化[1]。腎間質纖維化程度能夠客觀地反映腎臟細胞和腎臟功能受損情況，腎間質纖維化的發(fā)病機制涉及多個信號轉導通路，目前研究比較深入的是轉化生長因子-β1（transforming growth factor,TGF-β1）/Smad信號通路，該通路是腎間質纖維化發(fā)病的核心，通路涉及多個環(huán)節(jié)，主要包括炎癥反應和氧化應激等[2]。

TGF-β 參與體內多種生理病理過程，主要參與細胞存活、分化、遷移和黏附的調節(jié)。研究認為，TGF-β1/Smad 信號傳導通路在TGF-β 發(fā)揮促纖維化過程中起著重要的作用[3-4]。目前研究發(fā)現，唯一的細胞內Ⅰ型受體底物是Smad 家族蛋白，它在TGF-β在細胞膜和受體結合直至細胞核完成信使傳導、上調或者下調靶基因的轉錄過程中起關鍵作用；且有研究發(fā)現不同類型Smad 蛋白介導不同作用的TGF-β 信號傳導，其中Smad-2 蛋白是調節(jié)纖維化作用的關鍵蛋白[5-6]。

桅子為茜草科植物，臨床上常作為保肝利膽藥。梔子的主要有效成分為梔子苷，具有抗炎、抗氧化和抗糖尿病作用[7-9]，進一步研究發(fā)現梔子苷主要是通過抑制TLR/NF-κB/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）活性發(fā)揮抗炎作用，楊奎等[10]對抑制大鼠腦出血后炎癥反應從而減輕繼發(fā)性腦實質損害的研究表明：中、高劑量梔子苷（15 和30 mg/kg）能降低血腫周圍腦組織TNF-α 含量。NF-κB 存在于細胞質中，與TGF-β1/Smad 信號有交聯。TGF-β1/Smad 信號轉導途徑激活是器官纖維化等疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機制，同時也是腎間質纖維化主要和最終的共同通路[11]。故本研究以腎間質纖維化大鼠模型為研究對象，從TGF-β1/Smad 信號通路及氧化應激角度探討梔子苷對腎間質纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物

90%梔子苷（南京澤朗植提生物科技有限公司），白細胞介素-1β（IL-1β）（Ab-9，cat：A7098）、超氧化物歧化酶（SOD）（Ab-33/37，cat：B7022-1）、丙二醛 （MDA）（Ab-124，cat：B0407）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試劑盒購自美國R＆D 公司，抗-Smad2 抗體[EP784Y]（Ab40855）和抗-TGF-β1抗體（Ab92486）購自英國Abcam 公司。清潔級健康SD大鼠（180～200 g），雌雄各半，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（黑）2013-001。實驗經哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審查并批準。

1.2 腎間質纖維化模型復制及分組

將40 只SD 大鼠隨機分為對照組、正常大鼠灌胃組、模型組、30 mg/kg 和15 mg/kg 梔子苷組，每組8 只。所有大鼠適應性飼養(yǎng)1 周，模型復制前1 天禁食，自由飲水。參照徐志宏等[12]方法復制大鼠腎間質纖維化動物模型，具體方法簡述如下：10%水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，大鼠固定于手術臺(右側臥位)。備皮區(qū)常規(guī)位于左肋下偏背部。碘伏消毒液 （4.5 g/L）按常規(guī)消毒術區(qū)3 遍，鋪無菌孔巾。手術切口選在左側肋腰點，無菌手術刀切開皮膚，鈍性分離皮下組織及肌層，切開腹膜，直至清楚暴露出左側腎臟組織，分離左側腎動脈及左側輸尿管，然后7-0 絲線結扎腎下極及腎盞，無菌手術剪在線中間位置剪斷輸尿管。其中對照組大鼠僅分離出左側腎動脈及左側輸尿管。復位腎臟，生理鹽水沖洗腹腔，逐層縫合手術切口，切口皮膚涂碘伏后貼無菌貼膜。從術后第1 天開始灌胃給予不同劑量的梔子苷2 周。正常大鼠灌胃組予以15 mg/kg 梔子苷灌胃2 周。對照組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃2 周。

1.3 組織病理學觀察

取各組腎臟組織，10%中性甲醛固定后石蠟包埋，切片后進行HE 染色和天狼星紅染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4 生化指標測定

灌胃結束后，經腹主動脈采血，全自動生化儀檢測血清肌酐（serum creatinine,Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN），3 500 r/min 離心15 min 取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β、MDA和SOD 含量。

1.5 Western blotting 檢測腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達

取腎臟組織100 mg，加入組織裂解液提取腎臟組織總蛋白，經SDS-PAGE 電泳分離，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h 后，加入一抗工作液，4℃過夜，TBS-T 緩沖液洗膜5 次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T 洗膜5 次，10 min/次，采用ECL 法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎組織病理學變化

對照組大鼠腎臟組織腎小球、腎小管結構清晰，腎間質內未見炎癥細胞浸潤，無纖維組織增生，無系膜細胞或者基質組織增生；模型組腎小球基質組織增生，鮑曼囊擴張，腎小管上皮細胞腫脹、空泡樣變性、灶狀壞死、片狀萎縮，甚至可見上皮細胞壞死脫落于腎小管管腔內。腎間質炎癥細胞彌漫性浸潤，纖維組織增生，甚至呈片狀纖維化改變；給予30 或15 mg/kg 梔子苷后炎癥細胞浸潤少，腎小管排列較整齊，間質纖維化面積??；正常大鼠灌胃組腎臟組織腎小球、腎小管結構清晰，腎間質內未見炎癥細胞浸潤，無纖維組織增生。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學變化 （HE）

2.2 梔子苷對腎間質纖維化大鼠Scr 和BUN 的影響

各組大鼠Scr 和BUN 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，正常大鼠灌胃組Scr和BUN 水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），模型組大鼠Scr 和BUN 水平較對照組上升（P＜0.05），30 mg/kg 和15 mg/kg 梔子苷組大鼠Scr 和BUN水平與模型組比較呈劑量依賴性下降（P＜0.05）。見表1。

2.3 梔子苷對腎間質纖維化大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的影響

各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，正常大鼠灌胃組血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），模型組與對照組比較，IL-1β、TNF-α、MDA 含量增加，SOD 含量減少（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg 梔子苷組與模型組比較，IL-1β、TNF-α、MDA 含量呈劑量依賴性減少，SOD 含量呈劑量依賴性增加（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠Scr 和BUN 水平的比較 （n=8，μmol/L，±s）

表1 各組大鼠Scr 和BUN 水平的比較 （n=8，μmol/L，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 Scr BUN對照組 29.451±2.238 5.449±1.324正常大鼠灌胃組 27.318±1.976 4.985±2.240模型組 50.236±5.8541） 15.316±1.1421）30 mg/kg 梔子苷組 34.529±3.3542） 10.116±1.1442）15 mg/kg 梔子苷組 40.126±4.5252） 12.219±1.0172）F 值 69.586 148.716 P 值 0.000 0.000

2.4 梔子苷對腎臟組織中TGF-β1 和Smad-2蛋白表達的影響

模型組腎臟組織中TGF-β1和Smad-2 蛋白相對表達量較對照組增加（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg 梔子苷組TGF-β1、Smad-2 蛋白相對表達量與模型組比較，呈劑量依賴性減少（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg梔子苷組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad-2 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3 和圖2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較 （n=8，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較 （n=8，pg/ml，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α SOD MDA對照組 129.236±12.132 30.589±5.153 80.129±3.732 0.918±0.135正常大鼠灌胃組 128.650±14.723 31.351±3.452 83.344±2.878 0.864±0.098模型組 1 160.214±63.1391） 52.816±3.1351） 55.049±4.3141） 4.318±0.1921）30 mg/kg 梔子苷組 880.625±56.3492） 37.866±4.1842） 73.713±4.3992） 2.113±0.3982）15 mg/kg 梔子苷組 949.602±85.1192） 42.622±4.3772） 65.821±5.8762） 3.273±0.2462）F 值 819.428 438.605 211.097 23.761 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達的比較 （n=8，±s）

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達的比較 （n=8，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 TGF-β1 Smad-2對照組 0.183 0±0.016 9 0.065 6±0.006 2模型組 0.811 6±0.056 41) 0.378 2±0.023 11)30 mg/kg 梔子苷組 0.340 5±0.032 31)2) 0.120 9±0.013 31)2)15 mg/kg 梔子苷組 0.401 9±0.039 41)2) 0.152 1±0.014 21)2)F 值 59.292 73.470 P 值 0.000 0.000

圖2 梔子苷對腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達的影響

3 討論

腎間質纖維化是由多種細胞事件、多個分子參與、多個細胞信號轉導通路調節(jié)和相互作用的結果，其主要病理特征包括間質成纖維細胞增殖、細胞外基質過度積聚、腎小管上皮細胞間充質轉分化等[13]。其中，腎小管上皮細胞間充質轉分化和腎間質成纖維細胞的增殖是腎間質纖維化的主要因素。本研究HE 染色和酶聯免疫吸附試驗結果顯示，腎間質纖維化大鼠腎小球內基質增生、鮑曼囊擴張，小管上皮細胞腫脹，小管空泡變性、灶狀壞死，片狀萎縮，管腔內可見脫落壞死的上皮細胞，腎間質炎癥細胞彌漫浸潤，片狀纖維化；對照組和正常大鼠灌胃組組織病理學觀察腎小管上皮細胞及腎間質大致正常。上述形態(tài)學研究與相關文獻[14]報道一致，表明本實驗采用的動物模型復制方法可行且成功。給予梔子苷灌胃2 周后能夠改善炎癥細胞浸潤和腎小管上皮細胞腫脹程度，降低間質纖維化面積，經組織染色可看出腎小管結構清晰，管腔內無變性壞死的細胞，除上述變化外亦可見管壁上皮細胞排列規(guī)則，無萎縮，腎間質結構清晰，無纖維化表現。同時亦表明梔子苷抗腎間質纖維化主要表現在腎小管上皮細胞。

DONNAHOO 等[15]研究發(fā)現TNF-α 可以直接誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡反應，同時上調IL-1β 表達，這與筆者實驗結果相一致，即模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量增加，梔子苷灌胃后大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量降低，正常大鼠灌胃組和對照組上述指標無變化，表明炎癥反應參與腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，梔子苷通過減輕腎小管上皮細胞炎癥浸潤程度及下調TNF-α 和IL-1β 表達水平，從而減輕單側輸尿管梗阻（UUO）所致大鼠腎臟炎癥反應。30 或15 mg/kg 梔子苷灌胃后腎間質纖維化大鼠血清中炎癥因子IL-1β 和TNF-α 含量均降低，且呈劑量依賴性降低，SOD 活性升高，且隨著梔子苷濃度的增加而升高，MDA 含量降低，表明梔子苷能夠通過降低氧化應激和炎癥反應改善腎間質纖維化。吳虹等[16]、LIU等[17]研究與本實驗結果類似。

本實驗結果顯示，與對照組比較，模型組血清中SOD 含量降低，MDA 含量增加，梔子苷灌胃后與模型組比較血清中SOD 含量增加，MDA 含量降低，正常大鼠灌胃組和對照組比較上述指標無變化。SOD 是生物體內清除氧自由基的最主要的物質，可以阻斷并且對抗氧自由基對腎小管上皮細胞的損害及有可能修復已經受損的腎小管上皮細胞，是觀察細胞損傷、修復的直觀指標。結果表明梔子苷可以有效地提高UUO所致大鼠腎臟SOD 活力，增強抗氧化能力，修復受損腎小管上皮細胞，從而緩解腎間質纖維化過程。MDA水平能夠間接反映腎小管上皮細胞受損程度，是過氧化反應過程中產生的一種具有細胞毒性物質。結果表明和模型組比較灌胃30 和15 mg/kg 梔子苷后MDA水平下降，說明梔子苷能夠減輕UUO 所致腎小管上皮損傷。本實驗結果與李莎莎等[18]的結果相一致。

Scr 和BUN 是評估腎功能的2 個重要的指標，肌酐是肌肉組織中肌酸的代謝終產物，尿素氮為蛋白代謝終產物，兩者均有腎臟代謝排出體外。本研究發(fā)現模型組Scr 和BUN 含量都增加，灌胃給予不同濃度的梔子苷后能夠降低Scr 和BUN 含量，對照組和正常大鼠灌胃組Scr 和BUN 指標無差異。表明梔子苷改善腎間質纖維化作用。

TGF-β1是關鍵的促腎間質纖維化因子，其中TGF-β1是已知的最強的致纖維化細胞因子之一[19]，TGF-β1信號轉導途徑中，Smad-2 途徑是公認的、最重要的下游通路之一，是已知的唯一胞內激酶受體底物[5-6]。TGF-β1/Smad-2 信號通路是腎臟纖維化核心通路。通過實驗得知，相比對照組，模型組中大鼠腎臟TGF-β1及Smad-2 的表達增加，表明TGF-β1/Smad-2信號傳導通路參與UUO 所致腎間質纖維化過程。與模型組中腎臟組織中TGF-β1表達和Smad-2 比較，給予不同濃度的梔子苷能夠降低TGF-β1和Smad-2 蛋白的表達，表明梔子苷能夠通過降低TGF-β1和Smad-2蛋白的表達，改善腎間質纖維化。蘭天等[20]通過研究得出與本實驗相類似的結果。本研究結果顯示，灌胃30 和15 mg/kg 的梔子苷后大鼠腎臟組織中TGF-β1和Smad-2 蛋白表達無差異，為避免梔子苷對腎臟組織毒性，筆者未采取大劑量梔子苷進行研究，本課題組將在進行充分的細胞毒理性研究后根據劑量曲線進行進一步研究。

綜上所述，本研究以腎間質纖維化大鼠為研究對象，闡明梔子苷具有改善腎間質纖維化作用，其可能機制與通過降低炎癥因子IL-1β 和TNF-α 釋放，減輕氧化應激對腎臟組織損傷，以及降低TGF-β1和Smad-2 蛋白的表達有關。