何 穎，秦毅斌，段群棚，張藝杰，盧冰霞，胡庭俊，李曉玉，周英寧，周展宏，劉 磊，梁家幸，李 斌，蔣冬福，盧敬專，蘇乾蓮，劉 棋，趙 武

（1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，南寧530001）

豬腹瀉類疫病是造成仔豬大量死亡的重要原因之一，引發(fā)腹瀉的原因眾多，有營養(yǎng)性腹瀉、病毒性腹瀉、細菌性腹瀉和寄生蟲腹瀉等，其中以病毒性腹瀉造成的危害最為嚴重[1-3]。病毒性腹瀉病常為一種或多種病毒單獨或混合感染[4-5]，傳播迅速，臨床表現(xiàn)為豬腹瀉、嘔吐、脫水和死亡等[1]，耐過豬生長緩慢，飼料報酬率降低[6-9]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年研究表明，引起豬病毒性腹瀉的病原主要包括：豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）和豬丁型冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）等[2]。這4種病毒對各個年齡段的豬都易感，其中對哺乳和保育豬危害最大，病死率最高[7-9]。1978年PEDV首發(fā)于英國，2006年新型變異毒株在中國暴發(fā)流行[10-12]，隨后在亞洲、歐洲和美洲國家也相繼暴發(fā)，迅速發(fā)展為全球性流行[12-15]。1945年Doyle和Hutching于美國首次報道TGEV發(fā)生，1956年中國廣東省首次報道。近年來TGEV在歐洲和亞洲等國家廣泛流行并呈不斷上升趨勢。Woode和Bridge1974年在英國首次報道發(fā)現(xiàn)PoRV，隨后美國、法國和澳大利亞等國家相繼報道檢出PoRV。中國1982年首次從糞便中分離到PoRV[16-17]。PDCoV是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與豬腹瀉相關的冠狀病毒科新成員，臨床特征與PEDV和TGEV相似。自2012年在中國香港首次發(fā)現(xiàn)后，PDCoV已成為常見的豬腹瀉病致病病原[18-21]。廣西壯族自治區(qū)作為“十三五”規(guī)劃的全國生豬重點發(fā)展產(chǎn)區(qū)之一，近年來在養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展的同時，豬的傳染病越來越復雜和多樣化，腹瀉類疫病已經(jīng)成為困擾廣西壯族自治區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸因素之一[22-23]。為了進一步掌握廣西壯族自治區(qū)規(guī)模豬場病毒性腹瀉疫病的發(fā)生及流行趨勢，本研究對2013年1月至2018年10月從廣西壯族自治區(qū)14個地級市送檢的1547份腹瀉類疾病樣本，運用RT-PCR方法進行PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV 4種主要病毒性腹瀉疫病病原檢測，調(diào)查這4種病原的陽性率、混合感染情況，并分析其在不同季節(jié)、年份和地區(qū)的流行特點，為廣西壯族自治區(qū)豬主要病毒性腹瀉疫病的預防和控制提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2013年1月至2018年10月，采自廣西壯族自治區(qū)14個地級市共1547份腹瀉病料：南寧市（492份）、柳州市（83份）、桂林市（168份）、梧州市（20份）、北海市（82份）、防城港市（34份）、欽州市（38份）、貴港市（75份）、玉林市（250份）、百色市（100份）、賀州市（22份）、河池市（21份）、來賓市（88份）、崇左市（74份）。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL2000、2×TaqPCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen 生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中公開發(fā)表的各病毒的基因序列，利用MegAlign（DNA Star），Primer Premier 7.0軟件設計引物，引物均送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.2 病料處理及病毒DNA/RNA提取 取送檢的腹瀉豬的腸道和糞便等組織樣品，按1∶5加入生理鹽水，在組織研磨器內(nèi)進行研磨，反復凍融3次，4℃、10 000 r/min離心5 min后取上清，進行DNA/RNA抽提或保存于-70℃冰箱備用。按照 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書對樣品上清進行DNA/RNA提取，所獲得的DNA/RNA直接進行PCR/RT-PCR或置于-70℃保存。陽性對照由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存，陰性對照由ddH2O代替cDNA。

1.2.3 病毒目的基因片段擴增 利用特異性引物對樣品RNA進行RT-PCR擴增，反轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)：RNA模板7 μL、5×Prime-ScriptTM緩沖液2 μL、RT enzyme mix0.5 μL、下游引物0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應條件：42℃ 40min，反應產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)3.0 μL，總反應體系為25 μL。PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV的PCR擴增反應條件見表3。PCR反應結(jié)束后取10 μL RT-PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

表3 PCR反應程序Table 3 PCR amplification program

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 2013年1月～2018年10月，利用本實驗室建立的RT-PCR檢測方法對采自廣西南寧、柳州、桂林、梧州、北海、防城港、欽州、貴港、玉林、百色、賀州、河池、來賓和崇左等14個地級市的1547份腹瀉類樣品，分別進行PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV病原檢測，并分析這4種病毒在不同年份、不同地區(qū)和不同季節(jié)的感染情況。同一份樣品只能檢測到1種病原陽性的歸為單一感染，同時檢測到2種病原陽性的歸為二重感染，同時檢測到3種病原陽性的歸為三重感染，依次類推。

2 結(jié)果

2.1 病毒RT-PCR、PCR結(jié)果RT-PCR產(chǎn)物電泳后，分別觀察到492、309、612和627 bp處出現(xiàn)條帶，與預期片段相符（圖1）。

圖1 4種病毒的RT-PCR或PCR電泳結(jié)果Fig. 1 RT-PCR or PCR result for PEDV, PRoV, PDCoV and TGEV

2.2 不同年份豬場送檢腹瀉樣品中病毒檢測結(jié)果分析2013～2018年，送檢的規(guī)模豬場均存在PEDV、PoRV和PDCoV這3種病原不同程度的感染，樣品平均陽性率為54.94%、4.40%和4.52%。2013年和2014年，送檢腹瀉樣品中只檢出PEDV，陽性率分別為66.67%和47.95%；2015年送檢腹瀉樣品中檢出PEDV和PoRV，陽性率分別為51.93%和11.60%；2016年送檢腹瀉樣品中檢出PEDV、PoRV和PDCoV，陽性率分別為73.06%、7.25%和6.74%；2017年送檢腹瀉樣品中檢出PEDV、PoRV和PDCoV，陽性率分別為50.97%、2.72%和6.42%；2018年送檢腹瀉樣品中檢出PEDV、PoRV和PDCoV，陽性率分別為39.29%、1.49%和3.27%。另外，2013～2018年送檢腹瀉樣品中均未檢出TGEV病原（表4）。

表4 2013～2018年豬場腹瀉樣品中病毒檢測結(jié)果Table 4 Detection of PEDV, PRoV, PDCoV and TGEV in samples from pig farms during 2013-2018

2.3 豬場送檢腹瀉樣品中病毒混合感染檢測結(jié)果分析2013～2018年檢測結(jié)果顯示， PEDV單一感染率最高(55.27%)，其次是PoRV(2.97%)、PDCoV(2.78%)；同時混合感染中雙重感染較為常見，以PEDV+PDCoV(1.10%)和PEDV+PoRV(1.10%)為主；三重感染較少，PEDV+PoRV+PDCoV僅在2016年檢出5例，在2017年檢出1例，而TGEV均未檢出（表5）。

2.4 不同地區(qū)豬場送檢腹瀉樣品中病毒檢測結(jié)果分析2013～2018年，PEDV、PoRV和PDCoV感染在廣西壯族自治區(qū)14個地級市的規(guī)模豬場中均有發(fā)生。樣本中PEDV陽性率由高到低分別為：貴港、北海、玉林、百色、南寧、崇左、防城港、梧州、賀州、桂林、來賓、柳州和欽州市，河池市送檢樣本未檢出；PoRV陽性率由高到低為：河池、桂林、柳州、南寧、防城港、崇左、貴港、北海、玉林、來賓和百色市，梧州、欽州、賀州市樣本未檢出；PDCoV陽性率由高到低為：北海、百色、南寧、欽州、桂林、賀州、柳州、玉林、崇左和貴港市，梧州、防城港、河池、來賓市送檢樣本中未檢出；另外，所有樣本中均未檢出TGEV（表6）。

2.5 不同季度對4種病毒檢測結(jié)果的影響結(jié)果顯示，2013～2018年1547份廣西規(guī)模豬場腹瀉樣本中，TGEV在各季節(jié)中均未檢出；而PEDV、PoRV和PDCoV 3種病原在春季的樣品陽性率分別為50.43%、5.34%和8.12%，在夏季的樣品陽性率分別為45.19%、8.05%和1.56%，在秋季的樣品陽性率分別為60.49%、3.41%和0.49%，在冬季的樣品陽性率分別為63.19%、1.02%和5.11%（表7）。

表5 2013～2018年豬場送檢腹瀉樣品4種病毒混合感染情況Table 5 Mixed infection of PEDV, PRoV, PDCoV and TGEV in samples during 2013-2018

表6 2013～2018年廣西14個地級市4種豬腹瀉病毒檢測結(jié)果Table 6 Detection of PEDV, PRoV, PDCoV and TGEV in samples from 14 areas of Guangxi during 2013-2018

3 討論

豬腹瀉是豬場常見病和多發(fā)病，其中病毒性腹瀉主要由PEDV、PDCoV、PoRV和TGEV感染導致，臨床癥狀和病理變化上極其相似，給臨床診斷帶來困難。本研究對2013～2018年廣西14個地級市的規(guī)模豬場的腹瀉類樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV、PoRV和PDCoV這3種病毒性腹瀉疫病病原在廣西不同地區(qū)豬場中均存在不同程度的感染，但并未檢測到TGEV，其中PEDV的樣品陽性率、地區(qū)陽性率和季節(jié)陽性率在13個地市陽性檢出率均為最高，與其他生豬養(yǎng)殖大省如四川、山東和浙江等省所報道的規(guī)模豬場以PEDV腹瀉為主的情況相同，表明廣西豬流行性腹瀉已形成持續(xù)感染的地方流行態(tài)勢。2016年，曹恭貌等[20]對四川省部分地區(qū)的腹瀉樣品進行檢測，其中PEDV陽性率為100.00%，TGEV為11.54%，PoRV為7.69%。有調(diào)查結(jié)果顯示，山東省不同地區(qū)仔豬腹瀉樣品中PEDV、PoRV和TGEV的陽性率分別是34.9%、28.8%和2.2%[24-25]。徐麗華等[26]對浙江省部分地區(qū)的腹瀉樣本進行檢測，其中PEDV陽性率為71.25%，TGEV為3.05%，PoRV為17.6%，PDCoV為8.75%。調(diào)查結(jié)果表明PEDV仍是國內(nèi)引起規(guī)模豬場腹瀉疫病的主要病原。

表7 不同季節(jié)豬場送撿腹瀉樣品中病毒檢測結(jié)果Table 7 Detection of PEDV, PRoV, PDCoV and TGEV in samples in different seasons

通過比對PEDV的M基因序列發(fā)現(xiàn)，廣西2013～2014年的流行毒株與廣東、河北、武漢、安徽等省2010～2013年的流行毒株親緣關系較近[27]。本研究中PEDV在廣西南部和西南部靠近廣東省的養(yǎng)殖密集區(qū)域的地區(qū)，如貴港、北海、玉林、百色、南寧和崇左等市為PEDV感染高發(fā)區(qū)。除單獨感染外，PEDV還與PDCoV和PoRV存在不同程度的混合感染，其中雙重感染較常見，以PEDV+PDCoV和PEDV+PoRV為主，三重感染PEDV+PoRV+PDCoV較少。說明廣西PEDV、PDCoV和PoRV近年來發(fā)病率不斷增長，可能與養(yǎng)殖密集區(qū)域生豬養(yǎng)殖量不斷上升，及其造成的生豬流動如種豬引進、出售和商品豬區(qū)內(nèi)及跨省調(diào)運等行為的增多呈正相關趨勢。

PEDV表現(xiàn)為全年高發(fā)，在腹瀉疾病中的平均發(fā)病率高于50%，其中秋冬季最高，檢出率分別為60.49%、63.19%。同時PoRV和PDCoV春冬季感染率較高，并且PoRV主要感染的區(qū)域集中在河池、桂林和柳州市等廣西北部地區(qū)，與這些病原的流行特點相吻合，說明寒冷季節(jié)更有利于PoRV和PDCoV的感染和傳播[27]。另外，廣西地處中國西南，屬亞熱帶季風氣候，夏秋季時間較長且高溫多雨，氣候潮濕[5]。冬季氣候劇變，長時間持續(xù)低溫陰雨天氣，豬場防寒措施不足特別是哺乳仔豬的保暖不足，生物安全管理措施不到位，加上飼喂劣質(zhì)飼料甚至霉變飼料等更是加劇了腹瀉病毒的傳播。

合理制定免疫預防策略能夠有效預防和控制病毒性腹瀉疫病的暴發(fā)和流行。目前，廣西規(guī)?；i場仍采用疫苗作為主要防控腹瀉疫病的手段，廣泛使用的商品化疫苗有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗(WH-1株 + AJ1102株)，豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗（弱毒華毒株 + 弱毒CV777株+NX株）、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗(HB08株+ ZJ08株）和以CV777為基礎的PEDV滅活苗。本次針對這4種病毒性腹瀉類疫病的流行病學進行系統(tǒng)深入研究后發(fā)現(xiàn)，2017年以來，PEDV、PoRV和PDCoV的流行情況和流行范圍均有一定程度的下降，表明近兩年廣西對于腹瀉的防治取得了一定的進步，但陽性樣品率和地區(qū)陽性率仍處于較高水平，廣西PEDV、PoRV和PDCoV仍呈現(xiàn)持續(xù)感染的地方流行態(tài)勢。PEDV已經(jīng)成為引發(fā)廣西規(guī)模豬場流行性腹瀉的最主要病原，并且常與PoRV和PDCoV發(fā)生混合感染。對于健康發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)而言，PEDV是當前廣西豬病毒性腹瀉類疫病的防控重點。

由于近年來PEDV變異株的出現(xiàn)（基因II型為主），傳統(tǒng)的疫苗株（基因I型）已經(jīng)不能夠為動物提供針對流行毒株的保護力[28-29]，因此，顯得至關重要，建議使用與流行基因型相匹配的疫苗，才能獲得良好的免疫保護效果。研究結(jié)果顯示雖然近幾年來廣西規(guī)模豬場的TGEV感染率較低，但由于該病是豬腹瀉的常見病，一旦發(fā)生則死亡率極高，因此TGEV的預防也不容忽視。針對廣西規(guī)模豬場易發(fā)的PEDV+PDCoV和PEDV+PoRV等混合感染情況，應合理選擇有效的聯(lián)苗進行防治。