杜 琳，王麗芳，馮小慧，張三粉，宋 潔，姚一萍，史 培

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010010）

奶牛乳房炎是一種重要的奶牛疾病，主要是奶牛的乳腺組織受到物理、化學(xué)或微生物方面等因素刺激而引起的一系列炎性反應(yīng)[1]，可以造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多，常見的病原菌有傳染性病原菌（金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌）和環(huán)境性致病菌（大腸桿菌和克雷伯氏菌等）。奶牛乳房炎不僅給乳制品加工業(yè)帶來巨大損失，而且還危害公共衛(wèi)生安全和人類的健康[5]。目前，抗生素仍然是治療奶牛乳房炎的主要手段。隨著抗生素的不合理使用，導(dǎo)致奶牛乳房炎病原菌的耐藥性越來越明顯，甚至出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”[6]。同時(shí)殘留在牛奶中的抗生素也會(huì)引發(fā)部分消費(fèi)者發(fā)生過敏等變態(tài)反應(yīng)，長期飲用更可增加機(jī)體內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的可能[7]。金黃色葡萄球菌作為引起乳房炎的主要致病菌，其耐藥性引起了人們的廣泛關(guān)注[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料營養(yǎng)肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司； 藥敏試驗(yàn)藥物：氟苯尼考、氨曲南、利福平、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素、苯唑西林、妥布霉素、利奈唑胺、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、紅霉素和氨芐西林，由上海星佰生物技術(shù)有限公司定制成藥敏板；2×Easy Taq?PCR Super Mix、細(xì)菌基因組 DNA 小量純化試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 在生鮮乳主產(chǎn)地區(qū)內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、山東省、上海市、河北省共收集247批次患乳房炎病牛乳樣。其中內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、上海市、河北省各50份樣本，山東省47份。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集到的乳樣用滅菌棉拭子于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落形態(tài)。挑取疑似菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，進(jìn)行純培養(yǎng)，并對(duì)分離獲得的流行菌株編號(hào)，對(duì)分離時(shí)間、分離地點(diǎn)等信息進(jìn)行記錄歸檔。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 參照細(xì)菌基因組 DNA 小量純化試劑盒說明書，提取細(xì)菌基因組DNA。

以提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因。根據(jù)GenBank登錄的DNA序列設(shè)計(jì)通用引物，Bacterial 16s-F：5'-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGG CT-3'，Bacterial 16s-R：5'-CGCGGATCCGCTA CCTTGTTACGACTT-3'。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，75℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。預(yù)期目的條帶大小為1500 bp。

將PCR產(chǎn)物純化后連入pEasy-T1載體，轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，選取陽性克隆送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。所測基因序列與GenBank中已有序列進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離出的主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法進(jìn)行，用大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922）、糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC29212）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 （ATCC29213）、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC27853）作為質(zhì)控菌，根據(jù)CLSI（2016）的標(biāo)準(zhǔn)判斷其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌的分離 247份乳樣中共分離得到40株葡萄球菌，其中產(chǎn)色葡萄球菌1株，表皮葡萄球菌2株，巴氏葡萄球菌1株，松鼠葡萄球菌1株，腐生葡萄球菌5株，金黃色葡萄球菌30株，金黃色葡萄球菌分離率為12.15%。

金黃色葡萄球菌陽性率最高的是黑龍江省，分離率為24%；上海市和山東省兩個(gè)地區(qū)的分離率較低，分別為12%和8.5%。河北省未分離出金黃色葡萄球菌。

2.1.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 金黃色葡萄球菌在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上生長，呈黃色菌落，周圍有黃色的環(huán)，菌落形態(tài)見圖1。分離株呈革蘭氏陽性，葡萄串狀（圖2）。

圖1 金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of Staphylococcus aureus

圖2 金黃色葡萄球菌的菌體形態(tài)Fig. 2 Morphology of Staphylococcus aureus under the oil microscope

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)疑似菌株進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約1500 bp處擴(kuò)增出條帶，與目的片段大小相同。取16S rRNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析并Blast比對(duì)，30株為金黃色葡萄球菌，1株為產(chǎn)色葡萄球菌，2株為表皮葡萄球菌，1株為巴氏葡萄球菌，1株為松鼠葡萄球菌，5株為腐生葡萄球菌。

金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎主要傳染性病原菌，能夠損害乳房上皮細(xì)胞和腺泡，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量急劇下降，嚴(yán)重時(shí)可致奶牛死亡[10]。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎占20%～50%[11]。本調(diào)查中金黃色葡萄球菌的感染率（12.15%）明顯偏低，表明金黃色葡萄球菌在奶牛乳房炎中已經(jīng)得到了初步控制。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 金黃色葡萄球菌的耐藥情況 本研究中用于耐藥性試驗(yàn)的20種藥物來自11大類藥物，其中β-內(nèi)酰胺類7種、氨基糖苷類2種，四環(huán)素類1種，磺胺類1種，喹諾酮類2種，林可酰胺類1種，大環(huán)內(nèi)酯類1種，氯霉素類2種，糖肽類1種，噁唑烷酮類1種，安莎霉素類1種。

由于金黃色葡萄球菌感染一直采用抗生素療法，使其耐藥性問題日益嚴(yán)重，給金黃色葡萄球菌性乳房炎的治療帶來了很大的困難。本研究分離的30株金黃色葡萄球菌大部分具有不同程度的耐藥性，并且80%為多重耐藥菌（表1）。其中，耐單一藥物的有6株（20%）。耐藥種類數(shù)最多的1株金黃色葡萄球菌，能夠耐受11種藥物。單種藥物藥敏結(jié)果表明，所分離得到金黃色葡萄球菌對(duì)氨曲南的耐藥率最高，達(dá)到了100%，其次為青霉素（80%）、氧氟沙星（43.33%）、頭孢西?。?3.33%）和美羅培南（43.33%）耐藥率，均高于40%。耐藥率低于10%的為氟苯尼考（全部敏感）、萬古霉素（全部敏感）、苯唑西林（全部敏感）、利奈唑胺（全部敏感）、阿莫西林-克拉維酸（全部敏感）、氯霉素（3.33%）、復(fù)方新諾明（3.33%）、利福平（6.67%）和環(huán)丙沙星（6.67%）。檢測結(jié)果與王秋冬等2017年報(bào)道金黃色葡萄球菌耐藥性[12]和徐佳2015年報(bào)道的結(jié)果[13]有一定差異，可能不同年份、不同地區(qū)分離的金黃色葡萄球菌耐藥性存在差異。

2.2.2 金黃色葡萄球菌耐藥性區(qū)域情況比較 對(duì)各種抗生素而言，山東省分離的金黃色葡萄球菌耐藥率明顯小于其他三個(gè)地區(qū)的平均耐藥率，上海市分離的金黃色葡萄球菌具有最高的平均耐藥率。對(duì)于喹諾酮類，內(nèi)蒙古自治區(qū)分離的金黃色葡萄球菌平均耐藥率最高（環(huán)丙沙星12.5%，氧氟沙星75%）；對(duì)于磺胺類、氯霉素類，黑龍江省分離的金黃色葡萄球菌具有最高的平均耐藥率（復(fù)方新諾明8.33%，氯霉素8.33%）；對(duì)于安莎霉素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類，上海市分離的金黃色葡萄球菌具有最高的平均耐藥率（利福平33.33%、頭孢西丁83.33%、青霉素100%、美羅培南83.33%、慶大霉素33.33%、妥布霉素83.33%、林可霉素66.67%、紅霉素50%）。金黃色葡萄球菌的耐藥性在地方分布上有所差異，可能與不同地區(qū)的飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)過程中抗生素的使用不同等因素有關(guān)。因此，為了避免臨床上抗生素的濫用，進(jìn)行金黃色葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測尤為重要。使用獸藥時(shí)應(yīng)根據(jù)各地區(qū)流行菌株的耐藥特點(diǎn)，選擇敏感性高的藥物。同時(shí)在使用敏感性較高的藥物時(shí)，要考慮到動(dòng)物禁用藥物及泌乳期禁用藥物等因素，規(guī)范抗生素的使用，防止亂用、濫用抗生素，并且進(jìn)一步探索除抗生素外的治療和預(yù)防手段，如亞單位疫苗、噬菌體、中草藥等方法。

表1 金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug susceptibility test results of Staphylococcus aureus