宋晶晶，王盼舉，許正茂，艾日登才次克，王莉君，吾力江，張夢圓，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830011）

馬駑巴貝斯蟲病是馬駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）經(jīng)媒介蜱傳播寄生于馬屬動物（馬、驢、斑馬等）紅細(xì)胞內(nèi)引起的一種血液原蟲病。傳播媒介為森林革蜱、草原革蜱和銀盾革蜱等硬蜱[1]，呈急性、亞急性、慢性發(fā)病，臨床癥狀分心肺型和腸胃型，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸、水腫、肝腫大、血管內(nèi)溶血，血紅蛋白尿甚至是死亡等癥狀。馬駑巴貝斯蟲病是能影響全世界馬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要疾病之一，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)及溫帶地區(qū)[2-3]。馬駑巴貝斯蟲感染動物死亡率高，生產(chǎn)力低，管制措施成本高，并且可影響國際馬匹貿(mào)易和流動，從而造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。我國將其列為馬二類疫病，OIE（世界動物衛(wèi)生組織）將其列為B類疫病[4-6]。

馬駑巴貝斯蟲病臨床診斷通常采用血涂片染色方法來觀察紅細(xì)胞的染蟲情況。由于馬駑巴貝斯蟲在馬屬動物感染潛伏期長且呈慢性感染（帶蟲期），血涂片染色方法應(yīng)用于臨床大批量檢測需耗費(fèi)較大的財(cái)力、人力。雖然補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）均可有效檢測陽性樣品，但是補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)假陽性率高、敏感性低[6]。在對于急性或慢性及大批量檢測努巴貝斯蟲感染情況時(shí)，rELISA是目前最合適的檢測方法，該方法具有成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究以純化重組Bc48蛋白作為包被抗原的ELISA對新疆地區(qū)馬努巴貝斯蟲病進(jìn)行檢測，加大新疆地區(qū)該病的流行病學(xué)調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)血清、菌種和質(zhì)粒E.coli表達(dá)菌BL21感受態(tài)細(xì)胞、構(gòu)建成功的馬駑巴貝斯蟲Bc48基因原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1-Bc48、馬駑巴貝斯蟲病陽性血清、陰性血清均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

1.1.2 血清樣本來源 采自新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州和碩縣（40份），阿克蘇地區(qū)（11份），北疆阿勒泰地區(qū)富蘊(yùn)縣（29份），伊犁地區(qū)昭蘇縣洪納海鄉(xiāng)（21份），昭蘇縣種馬場（111份）伊犁卡拉蘇（24份）共256份馬匹血樣，常規(guī)方法分離血清，-20℃保存、備用。

1.1.3 主要試劑 IPTG、氨芐霉素（Amp+）、吐溫（Tween） 均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker 購自北京全式金生物有限公司；ELISA酶標(biāo)板購自NUNC公司；鼠抗馬IgG-HRP購自BETHYL公司；氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、氫氧化鈉、氯化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Bc48重組進(jìn)行蛋白的制備 將原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1-Bc48轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，將鑒定為陽性的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后，采用KCl染色切膠純化Bc48蛋白[8]，純化后用BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測定。

1.2.2 ELISA檢測 用PBS將切膠純化后的目的蛋白稀釋為最適工作濃度0.8 μg/mL，采用碳酸鹽包被酶標(biāo)板，按照每孔100 μL加至反應(yīng)板中，4℃過夜。 每孔加入200 μL PBST（0.5%吐溫）清洗5次，甩掉液體拍干后，每孔加入3%的脫脂乳（200 μL），37℃下封閉2 h。

將封閉好的反應(yīng)板洗滌5次，拍干。待檢血清用封閉液50倍稀釋后加至反應(yīng)板，每個樣品重復(fù)3個反應(yīng)孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h，同時(shí)加入陰性、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清作為對照。將反應(yīng)板洗滌5次甩凈液體后拍干，加入10 000倍稀釋后的二抗，每孔100 μL，37℃孵育1h。洗滌反應(yīng)板后，每孔加入100 μL TMB顯色液，37℃作用15 min后，每孔加入100 μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm處進(jìn)行讀數(shù)。血清樣本OD450≤0.221時(shí)，判定為陰性；OD450值＞0.221時(shí)，判定為陽性[9]。

2 結(jié)果

2.1 Bc48重組蛋白誘導(dǎo)及純化結(jié)果電泳結(jié)果顯示，37℃、終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h可成功表達(dá)出分子量約36 kDa目的蛋白，且Bc48重組蛋白以包涵體的形式存在（圖1）。利用0.25 mol/L的KCl染色切膠純化方法獲得大量高純度的目的蛋白（圖2）。SDS-PAGE結(jié)果顯示純化效果較好，經(jīng)BCA法測定濃度為360 μg/mL。

圖1 Bc48重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of Bc48 recombinant proteins

圖2 Bc48重組蛋白的純化結(jié)果Fig.2 Purification result of Bc48 recombinant protein

2.2 南北疆疫區(qū)馬駑巴貝斯蟲病 rELISA樣品檢測結(jié)果采用rELISA法對新疆南北地區(qū)256份血清進(jìn)行馬駑巴貝斯蟲抗體檢測，結(jié)果顯示，南疆和碩、阿克蘇地區(qū)馬駑巴貝斯蟲陽性率分別為30%（12/40）、9%（1/11）；北疆伊犁種馬場、洪納海鄉(xiāng)、卡拉蘇和阿勒泰富蘊(yùn)、阿尕什敖包鄉(xiāng)地區(qū)陽性感染率分別為17%（19/111）、17%（4/21）、12.5%（3/24）、5%（1/20）、35%（10/29），阿勒泰富蘊(yùn)縣感染率最高。

3 討論

馬駑巴貝斯蟲病現(xiàn)為OIE指定檢測馬屬動物寄生蟲病之一，患病馬匹往往通過媒介蜱傳播且呈常年攜帶狀態(tài)[5-6]。新疆駑巴貝斯蟲病發(fā)病率及死亡率較高[10]，因此相關(guān)檢測技術(shù)的研究顯得尤為重要。馬駑巴貝斯蟲呈常年攜帶狀態(tài)，并且對于臨床癥狀不明顯的馬匹，臨床診斷或血液涂片檢查都難以確診，“帶蟲馬”的漏診可造成傳染源被忽略。

馬駑巴貝斯蟲二溫式、熒光PCR檢測方法已被報(bào)道[11]，雖然具有更高的特異性及靈敏度，但對于基層大量樣品的檢測及硬件條件設(shè)備等需求較高。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)及KCl染色純化的Bc48重組蛋白作為rELISA基礎(chǔ)包被抗原，具有較強(qiáng)的特異性，陽性符合率達(dá)到95%，這與前期多次臨床經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用密切相關(guān)[12-14]，可以更好的實(shí)時(shí)監(jiān)測馬駑巴貝斯蟲病的感染情況。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，在伊犁、阿勒泰、塔城及巴州等地區(qū)，馬駑巴貝斯蟲病感染率較高，但此次調(diào)查結(jié)果顯示北疆伊犁，阿勒泰地區(qū)的感染率有所降低，可能是近兩年科技宣傳和驅(qū)蟲方法比較到位。

表1 新疆部分馬駑巴貝斯蟲病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果Table 1 Serological investigation of Babesia caballi infection in Xinjiang

也有報(bào)道指出，馬駑巴貝斯蟲作為蜱傳播的病原體也是馬駑巴貝斯蟲病的致病因子，能夠不同程度的感染馬屬動物，造成直接或間接經(jīng)濟(jì)損失[15-16]。因此，疫區(qū)實(shí)時(shí)監(jiān)測馬駑巴貝斯抗體情況顯得尤為重要，可為研究人員評估相關(guān)的危險(xiǎn)因素及驅(qū)蟲藥/疫苗的使用提供依據(jù)。地方人員也應(yīng)在媒介硬蜱活動季節(jié)采取一定的預(yù)防和控制措施，制定和改進(jìn)防控措施，降低馬匹疫病帶來的經(jīng)濟(jì)影響。