閻曉菲 ，孔 苗 ，韓紅玉 ，董 輝 ，黃 兵

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊830052; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室, 上海 200241）

雞球蟲病是一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞而引起的一種原蟲寄生蟲病。在集約化養(yǎng)雞場中發(fā)病率達(dá)50%～70%，甚至80%以上，死亡率20%～30%。全世界每年因雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億英鎊。我國每年花費約20億人民幣進(jìn)行預(yù)防，其中并不包括由雞球蟲病的隱性感染造成的間接損失[1-2]。堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）有較強致病性，寄生于十二指腸和空腸，在集約化養(yǎng)雞場中流行率最高，對養(yǎng)雞業(yè)的危害僅次于柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）[3]。目前防治球蟲病主要依賴于抗球蟲藥物和活卵囊疫苗，但隨著球蟲耐藥性不斷產(chǎn)生，藥物預(yù)防己經(jīng)不能很好的防治球蟲病?；盥涯乙呙珉m然已經(jīng)在國內(nèi)外上市，但由于免疫效果和安全性問題，并未得到廣泛推廣使用[4]，因此必須采取新的措施防治雞球蟲病。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建的基因工程疫苗已被證實可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生長期的體液免疫和細(xì)胞免疫[5]，因此安全有效的基因工程疫苗的研制及應(yīng)用將逐漸成為防治雞球蟲病的主要手段。

生物細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運ATP酶除參與主動轉(zhuǎn)運和ATP合成基本過程外，在細(xì)胞能動性和生長發(fā)育、受體再循環(huán)、蛋白質(zhì)選擇等方面也有重要作用[6]。多種生物的ATP酶相關(guān)基因克隆、表達(dá)及功能研究均有報道，如微生物炭疽菌[7]和耐氟菌[8]，動物三疣梭子蟹[9]和小地老虎[10]，植物小麥[11]和向日葵[12]。柔嫩艾美耳球蟲ATP酶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)EST序列已有報道[13]，研究人員通過不同分離株的ATP酶基因遺傳多態(tài)性來分析抗球蟲藥的耐藥性[14]。本研究所獲得的堆型艾美耳球蟲基因經(jīng)Blast分析，與陽離子轉(zhuǎn)運的ATP酶同源，命名為堆型艾美耳球蟲Na+-K+-ATP酶（E. acervulinaNa+-K+-ATPase，EaNKA）[15]，對其進(jìn)行克隆與表達(dá)，為今后進(jìn)一步研究該基因的功能及篩選基因工程疫苗候選分子奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種及主要試劑 堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫[16]由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供；pET32a（+）原核表達(dá)載體和大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)系實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ和T4DNA連接酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×TaqPCR Master MIX、DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA/蛋白質(zhì)Marker、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)堆型艾美耳球蟲基因序列[17]（GenBank登錄號：EU590120.1），利用Primer Primier5.0軟件設(shè)計1對擴(kuò)增Na+-K+-ATP酶基因的特異性引物，并在上、下游引物5'端分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點（下劃線）和相應(yīng)的保護(hù)性堿基。預(yù)計擴(kuò)增目的片段約708 bp，上游引物：5'-CG CGGATCCATGTACGCCCAAGAAGAAGC-3'，下游引物5'-CCCAAGCTTTCAATAACGAAGCAGA GAG-3'，由生工生物工程上海（股份）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1EaNKA基因的克隆與測序 以堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為40 μL：2×Taq PCR Master MIX 20 μL，cDNA文庫 10 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果?；厥债a(chǎn)物按照T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒的說明進(jìn)行連接。連接體系為10 μL：ddH2O 4.5 μL、目的DNA片段1.5 μL、pUCM-T 1 μL、10×Ligation Buffer 1 μL、50% PEG 4000 1 μL、T4DNA ligase 1 μL?；靹蚝?℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定正確后送生工生物工程上海（股份）有限公司測序。

1.2.2EaNKA基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的在線軟件ORF finder分析獲得的新基因全長cDNA序列，找出ORF；利用ProtParam工具（http://cn.expasy.org /tools/protparam.html）分析編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的親疏水性；利用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SOPMA分析編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SingalP在線工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析編碼蛋白有無信號肽；利用TMH服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分析編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；利用PSORTⅡ（http://posrt.nibb.ac.jp/）分析亞細(xì)胞定位；利用北京大學(xué)生物信息學(xué)中心WebLab的Antigenic（http://weblab.cbi.pku.edu.cn/）程序分析其抗原位點；利用motif_scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）分析功能結(jié)構(gòu)域；利用Blast進(jìn)行序列比對。

1.2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA的構(gòu)建與鑒定 利用BamHⅠ和HindⅢ對克隆質(zhì)粒TEaNKA和空載體pET32a（+）分別進(jìn)行雙酶切，連接目的基因與空載體膠回收酶切產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA，連接體系為10 μL：dd H2O 3 μL、目的基因回收產(chǎn)物3 μL、10×Buffer 2 μL、pET32a（+）回收產(chǎn)物1 μL、T4DNA ligase 1 μL。4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行PCR鑒定。對鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒并用BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆送生工生物工程上海（股份）有限公司測序，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA的原核表達(dá)及重組蛋白的Western blot分析 將過夜培養(yǎng)的陽性菌液轉(zhuǎn)接震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0，加IPTG至終濃度為0.9 mmoL/L，并分別在2、4、6、8 h取出500 μL培養(yǎng)物。培養(yǎng)物于室溫、1000×g離心30 s，棄上清，沉淀中加入50 μL 1×loading buffer，混勻后100℃水浴煮10 min，SDS-PAGE檢測分析。常規(guī)SDS-PAGE后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜；以大腸桿菌裂解液預(yù)吸收的兔抗堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊抗血清（1∶500）為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶5000）為二抗進(jìn)行Western blot檢測；最后用DAB試劑盒顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 EaNKA基因的克隆與鑒定以堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊 cDNA 文庫為模板，利用合成的引物PCR擴(kuò)增EaNKA基因ORF片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在708 bp 處有一特異性的條帶，與目的片段大小一致（圖1）。將其回收后與pUCM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測序鑒定正確，表明成功擴(kuò)增獲得EaNKA基因含ORF的cDNA片段。

2.2 EaNKA基因的生物信息學(xué)分析根據(jù)EU590120基因序列的ORF設(shè)計引物擴(kuò)增獲得EaNKA基因。測序拼接后，該基因全長1157 bp，ORF位于81-788 bp之間，長708 bp，編碼236個氨基酸（圖2）。EU590120.1基因全長754 bp，ORF位于17～508 bp之間，長492 bp，編碼163個氨基酸。兩基因序列同源性99%，EaNKA基因序列全長及ORF片段均長于EU590120.1基因序列。雖然EaNKA基因的ORF片段比EU590120.1基因的ORF片段多216 bp，但多出的堿基沒有造成之前氨基酸的改變。這可能是由于該基因在轉(zhuǎn)錄后的剪切過程中存在多種形式[18]，因可變剪接形成了不同的轉(zhuǎn)錄本，推測可能是屬于多基因家族[19]。

圖1 EaNKA基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 PCR result of EaNKA gene and analysis of the recombinant plasmids with restriction endonucleases digestion

生物信息學(xué)分析顯示EaNKA基因編碼蛋白理論分子量為25.43 kDa，理論等電點為7.58，酸性氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）18個，堿性氨基酸總數(shù)（Arg+Lys）19個，氨基酸組成較多的有Ala（A）14.0%，Leu （L）9.3%，Ser（S）8.9%，Val（V）8.1%，分子式為C1125H1796N306O324S20，總平均親水性（GRAVY）0.358，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)42.81，高于域值40，在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，脂肪族指數(shù)96.82。在該基因編碼的氨基酸中，親水性氨基酸分布少于疏水性氨基酸，根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強和分值越高疏水性越強的規(guī)律[20]，推測該蛋白為疏水性蛋白。信號肽預(yù)測分析，S平均值＜0.5，由此推斷該蛋白不存在信號肽，不屬于分泌蛋白[21]，表明該蛋白可以高效表達(dá)[22]。跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白具有2個跨膜結(jié)構(gòu)，91～113氨基酸和128～150氨基酸位于跨膜區(qū)。疏水性分析顯示最大值為3.078，最小值為-1.867，在18-35，49-61，91-113，131-148位之間有很強的疏水性。

抗原位點分析（表1），主要的抗原表位區(qū)有7個，為N端13-41、91-115、122-150、48-75、163-176、189-203、77-82位點，推測該蛋白具有良好的免疫原性，可能是很好的藥物靶標(biāo)[23]。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示（圖2），該蛋白序列有1個N-糖基化位點，3個酪蛋白激酶II磷酸化位點，4個N-肉豆蔻酰化位點，2個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，1個FMRF amide相關(guān)肽家族位點。其中N端糖基化位點與抗原性和免疫原性有關(guān)，蛋白激酶C磷酸化位點與介導(dǎo)胞外分泌有關(guān)，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位點與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)，N端豆蔻酰基化位點可能與蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體外膜有關(guān)，許多跨膜蛋白受體都具有蛋白激酶C磷酸化位點和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點[24]。酪氨酸激酶磷酸化位點可能有助于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的激活[25]，F(xiàn)MRF amide相關(guān)肽家族位點可能是一類新型離子受體[26]。PSIPRED分析二級結(jié)構(gòu)（圖3）共有10個α螺旋，1個β折疊，PSIPRED分析二級結(jié)構(gòu)[27]（圖3），112個氨基酸構(gòu)成α-螺旋，占47.46%，48個氨基酸構(gòu)成延伸鏈，占20.34%，19個氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占8.05%，57個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占24.15%。

圖2 EaNKA基因的核苷酸序列及其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)功能域分析Fig.2 Nucleotide、predicted amino acid sequences and analysis of the functional motifs of EaNKA gene

表1 EaNKA編碼蛋白的抗原肽位點分析Table1 Analysis of the antigenic peptides of EaNKA protein

利用swiss-model進(jìn)行蛋白高級結(jié)構(gòu)建模，與蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖4）。二、三級結(jié)主。無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位，易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象[28]，從而影響蛋白質(zhì)的功能。亞細(xì)胞定位分析顯示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、質(zhì)膜、線粒體、液泡中分別占55.6%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%，因此推測該基因編碼蛋白可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白受體。朱笠[29]研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型肌張力障礙相關(guān)蛋白質(zhì)torsinA是一種新型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可能起到類似分子伴侶的作用，幫助一些分泌型蛋白質(zhì)的成熟和分泌，或參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。Blast分析顯示該基因編碼的氨基酸與堆型艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶相關(guān)蛋白序列（XP013248919、ACB97673）的相似性最高為100%；與巨型構(gòu)為混合型蛋白，主要以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運AT P酶相關(guān)蛋白序列（XP013337038）的相似性為86%；與柔嫩艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶相關(guān)蛋白序列（APY19976）的相似性為87%，因此命名該基因為堆型艾美耳球蟲陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶（Eimeria acervulinaNa+-K+-ATPase，EaNKA）。

圖3 EaNKA基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Analysis of the secondary structure about the EaNKA protein

ATP酶是一種起源于同一個祖先和存在于所有生物體內(nèi)的酶系統(tǒng)，與離子電化學(xué)梯度之間的能量交換是生命活動的基本特征[30]，普遍存在于細(xì)胞組織及細(xì)胞器膜上[31]，是機體中離子調(diào)控的重要蛋白酶，通過建立離子跨膜電化學(xué)梯度并催化ATP水解成ADP而釋放能量，為各種離子的轉(zhuǎn)運提供最終的驅(qū)動力[32]。Na+-K+-ATP酶活性降低可引起細(xì)胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運障礙，能量代謝和物質(zhì)代謝紊亂，以及胞漿內(nèi)Ca+的積聚，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的異常，甚至細(xì)胞凋亡[33]。研究表明莫能霉素可以影響柔嫩艾美耳球蟲，從而在胞外殺死球蟲[34]跨膜鈉離子作為載體的能力，降低了ATP酶的濃度[34]。通過改變?nèi)崮郯蓝蛳x細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性，可以降低莫能霉素的敏感性[35]。通過流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合電鏡和熒光免疫技術(shù)，研究青蒿素對柔嫩艾美耳球蟲配子體的效果，發(fā)現(xiàn)青蒿素通過抑制大配子體的肌質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca+-ATP酶（SERCA），從而影響卵囊壁和孢子體形成[36]。以上研究表明，Na+-K+-ATP酶和Ca+-ATP 酶活性改變，可成為判定生物體生理功能改變的重要指標(biāo)。

2.3 重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA的構(gòu)建利用BamHⅠ和Hind Ⅲ對鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pUCM-T-EaNKA和空載體pET32a（+）分別進(jìn)行雙酶切，膠回收純化后連接，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA。對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果顯示均為陽性，測序結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA構(gòu)建成功（圖1）。

2.4 重組蛋白His-EaNKA的原核表達(dá)及Western blot分析重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA和空質(zhì)粒pET32a（+）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，經(jīng)0.9 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET32a（+）-EaNKA表達(dá)的重組蛋白分子量約為45 kDa左右，與目的蛋白分子量一致（圖5）。Western blot顯示，大腸桿菌裂解液預(yù)吸收的兔抗堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊抗血清，能特異性識別重組蛋白，在45 kDa處出現(xiàn)1條明顯的條帶，空質(zhì)粒對照組無明顯條帶（圖6），表明該基因可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。

圖4 EaNKA基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Analysis of the tertiary structure about the EaNKA protein

圖5 重組質(zhì)粒不同時相表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression products of recombinant plasmids

目前已篩選出一些可用于雞球蟲基因工程疫苗研制的候選基因，如柔嫩艾美耳球蟲GX3262基因[37]、白細(xì)胞介素2（cSZ-2）基因[38]、MZ5-7基因[39]，這些基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫雞后能夠有效減輕病變特征，增強宿主免疫力。Zhao等[40]對堆型艾美耳球蟲3-1E基因進(jìn)行克隆表達(dá)，Western blot分析表明重組蛋白可以與His-Tag（2A8）小鼠mAb特異性反應(yīng)，獲得了具有良好生物活性的蛋白，為開發(fā)核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。研究人員克隆堆型艾美耳球蟲巨噬細(xì)胞移動抑制因子，構(gòu)建DNA疫苗，檢測目的基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染情況，得到有效表達(dá)，并能顯著減輕感染雞體重降低和十二指腸損傷[41]。對堆型艾美耳球蟲乳酸脫氫酶（LDH）或LDH與雞IL-2或IFN-γ組合的DNA疫苗進(jìn)行了評估，證明攜帶LDH抗原基因的DNA疫苗可誘導(dǎo)同源感染的保護(hù)性免疫，其作用可通過雞IL-2或IFN-γ的共表達(dá)得到增強[42]。Zhu等[43]以堆型艾美耳球蟲子孢子cDNA克隆cSZ-JN2基因，構(gòu)建的重組蛋白疫苗能顯著提高免疫雛雞的平均體重增長率，降低平均病變比例和卵囊產(chǎn)量，且抗球蟲指數(shù)大于165。叢培君[44]構(gòu)建了雞堆型艾美耳球蟲乳酸脫氫酶增強型核酸疫苗，并進(jìn)行免疫保護(hù)研究，為探討開發(fā)研制新型免疫增強型抗球蟲核酸疫苗提供了理論基礎(chǔ)。黃藝華[45]構(gòu)建了雞堆型艾美耳球蟲Rhomboid增強型核酸疫苗，為研制抗球蟲病疫苗提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究克隆獲得的EaNKA基因蛋白與陰離子轉(zhuǎn)運ATP酶相關(guān)，具有多個抗原位點，并能夠與堆型艾美耳球蟲抗血清特異性結(jié)合，具有一定的反應(yīng)原性，為篩選疫苗候選分子提供了科學(xué)依據(jù)。

圖6 重組蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant proteins