寧培勇，紀學悅，丁津華，費春楠，張磊

（1.天津市疾病預防控制中心 預研所，天津 300011；2.天津施特雷生物科技股份有限公司，天津 300350）

內(nèi)鏡是一種常用的醫(yī)療器械，由可彎曲部分、光源及一組鏡頭組成。經(jīng)人體的天然孔道或手術(shù)切口進入，可直接窺視有關(guān)部位的變化。隨著近代科技的發(fā)展，上世紀60年代光學纖維應(yīng)用于內(nèi)鏡結(jié)構(gòu)，使得內(nèi)鏡診療技術(shù)得到了飛速發(fā)展，作為醫(yī)生眼和手的延伸，已經(jīng)達到了“無孔不入”的境界。但是，近年來大量內(nèi)鏡相關(guān)感染不斷被報道，其中也不乏暴發(fā)事件。由內(nèi)鏡相關(guān)感染引起的嚴重危害，在全球范圍內(nèi)是一個新的公共健康威脅，已引起醫(yī)務(wù)人員和患者的高度重視[1]。內(nèi)鏡由于材料特殊、結(jié)構(gòu)復雜及價格昂貴，去除污染物和清洗消毒的難度較高[2]。KOVALEVA[3]報道，由于對內(nèi)鏡清洗消毒等再處理程序不徹底，在使用內(nèi)鏡進行診療過程中，會引起多重耐藥的腸桿菌、綠膿桿菌等爆發(fā)感染。因此，做好內(nèi)鏡的清洗消毒滅菌工作，對防止醫(yī)源性感染十分重要[4-5]。我國先后制定了相關(guān)的標準以規(guī)范內(nèi)鏡的再處理過程及評價方法，參見GB15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》[6]和WS507-2016《軟式內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》[7]。本文分別采用胰蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基法（tryptone glucose extract agar，TGEA）和普通營養(yǎng)瓊脂法進行終末漂洗水微生物學監(jiān)測；采用試劑盒過濾集菌法和傳統(tǒng)過濾集菌法進行內(nèi)鏡消毒質(zhì)量微生物學監(jiān)測，對比不同方法的差異性，以探求實用、簡便和可靠的檢測方法，從而反應(yīng)內(nèi)鏡消毒質(zhì)量真實水平，確保內(nèi)鏡診療的安全進行。

1 資料與方法

1.1 一般資料

軟式內(nèi)鏡細菌監(jiān)測采樣收集和培養(yǎng)系統(tǒng)-試劑盒過濾集菌見圖1[8]，由天津施特雷生物科技股份有限公司提供；Combisart?微生物限度三聯(lián)不銹鋼過濾器-傳統(tǒng)過濾集菌，由德國賽多利斯（Sartorius）公司提供。

1.2 研究對象

2018年天津市14個區(qū)開展內(nèi)鏡業(yè)務(wù)的24家醫(yī)療機構(gòu)，每家機構(gòu)隨機抽取1或2條內(nèi)鏡作為研究對象，共30個樣本。

1.3 研究方法

圖1 軟式內(nèi)鏡細菌監(jiān)測采樣收集和培養(yǎng)系統(tǒng)Fig.1 A collecting and culture system for flexible endoscopic bacterial monitoring

1.3.1 取樣抽取內(nèi)鏡中心終末漂洗水及內(nèi)鏡洗脫液樣品。取樣時遵循無菌操作的原則，在水處理系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)的情況下，用75.0%乙醇常規(guī)消毒采樣口，打開閥門沖洗1 min后，用無菌采樣瓶采集終末漂洗水水樣300 ml；用含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液100 ml從內(nèi)鏡活檢口灌洗內(nèi)鏡管道，收集洗脫液，4 h內(nèi)送檢。

1.3.2 終末漂洗水微生物學監(jiān)測各取水樣100 ml于無菌過濾杯內(nèi)，用三聯(lián)不銹鋼過濾器抽濾集菌，取下濾膜分別貼附于TGEA培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面（當中不得留有氣泡）進行培養(yǎng)。TGEA法為20℃培養(yǎng)168 h，普通營養(yǎng)瓊脂法為36℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)（CFU/100 ml）。

1.3.3 內(nèi)鏡消毒質(zhì)量監(jiān)測將洗脫液充分混勻，取洗脫液1 ml接種平皿，將冷至40～45℃的熔化普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基每皿傾注15～20 ml，36℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)（CFU/平板）。將剩余洗脫液均分各半，分別采用試劑盒過濾集菌法和傳統(tǒng)過濾集菌法進行過濾集菌。試劑盒法注入普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，使其均勻覆蓋在濾膜表面；傳統(tǒng)過濾法將濾膜貼附于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面（當中不得留有氣泡），36℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)。當濾膜法不可計數(shù)時：菌落總數(shù)（CFU/件）=m（CFU/平板）×50（m為兩平行平板的平均菌落數(shù)）；當濾膜法可計數(shù)時：菌落總數(shù)（CFU/件）=m（CFU/平板）+mf（CFU/濾膜）（m為兩平行平板的菌落數(shù)和，mf為濾膜上菌落數(shù)）。

1.3.4 信息調(diào)查方法采用普查的方法，自主設(shè)計相關(guān)信息調(diào)查表，通過采樣人員現(xiàn)場問答、記錄的形式，調(diào)查內(nèi)鏡中心對內(nèi)鏡清洗消毒效果的自檢情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理。終末漂洗水、內(nèi)鏡消毒效果菌落數(shù)的檢出率采用χ2檢驗；因各組檢測結(jié)果（菌落數(shù)）為非正態(tài)分布，故采用四分位間距M（P25，P75）進行統(tǒng)計描述。終末漂洗水、內(nèi)鏡消毒效果利用方差分析比較不同測試方法所得菌落數(shù)（Log值）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Bland-Altman分析評價各種方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)鏡消毒的不同測試方法菌落數(shù)檢出率比較

以菌落數(shù)≥1 CFU為陽性結(jié)果，計為檢出。終末漂洗水：TGEA法和營養(yǎng)瓊脂法菌落數(shù)檢出率依次為96.7%和73.3%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.71，P=0.030）；內(nèi)鏡消毒效果：試劑盒過濾集菌法和傳統(tǒng)過濾集菌法菌落數(shù)檢出率依次為60.0%和56.7%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.07，P=0.793）。

2.2 內(nèi)鏡消毒的不同測試方法菌落數(shù)結(jié)果

終末漂洗水：TGEA法菌落數(shù)（Log10值）高于營養(yǎng)瓊脂法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。內(nèi)鏡消毒效果：試劑盒過濾集菌法和傳統(tǒng)過濾集菌法菌落數(shù)相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 內(nèi)鏡消毒的不同測試方法細菌計數(shù)一致性分析

采用Bland-Altman圖進行兩種方法的一致性評價，漂洗水TGEA法與營養(yǎng)瓊脂法（n=30）組Log10（菌落數(shù)）差值的均值及其標準差（±1.96SD）為0.69（-0.35，1.73），內(nèi)鏡試劑盒過濾集菌法與傳統(tǒng)過濾集菌法（n=30）組為-0.07（-0.48，0.33）。各組所得菌落數(shù)的比值見表3。終末漂洗水TGEA法與營養(yǎng)瓊脂法差值、比值均較大，一致性較差；內(nèi)鏡消毒效果試劑盒過濾集菌法與傳統(tǒng)過濾集菌法的差值、比值均值較小，一致性較好，見圖2和3。

2.4 內(nèi)鏡中心內(nèi)鏡消毒效果自檢情況

內(nèi)鏡中心對終末漂洗水及內(nèi)鏡消毒質(zhì)量的監(jiān)測水平較低、采用的檢測方法規(guī)范性差。見表4。

表1 不同測試方法檢測終末漂洗水菌落計數(shù)比較[M（P25，P75）]Table 1 Comparison of colony counts on final rinse water detected by different test methods[M（P25，P75）]

表2 不同測試方法檢測內(nèi)鏡菌落計數(shù)比較[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of colony counts on endoscope detected by different test methods[M（P25，P75）]

表3 不同測試方法所得菌落數(shù)的比值Table 3 Ratio of colony counts by different test methods

圖2 終末漂洗水：TGEA法與營養(yǎng)瓊脂法Log10（菌落數(shù)）差值的均值及其范圍Fig.2 Final rinse water：mean value and range of Log10（colony number）difference between TGEA method and nutritional agar method

表4 醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)鏡消毒效果自檢情況Table 4 Self-checking of endoscopy disinfection effect in medical institutions

圖3 內(nèi)鏡消毒效果：試劑盒過濾集菌法與傳統(tǒng)過濾集菌法Log10（菌落數(shù)）差值的均值及其范圍Fig.3 Endoscope disinfection effect：mean value and range of Log10（colony number）difference between reagent kit membrane filtration and traditional membrane filtration

3 討論

過濾集菌法，適用于低濃度液體標本菌種分離和計數(shù)，可提高細菌檢出率。該方法通過加大采樣液體量，使采樣時對內(nèi)鏡管腔進行充分清洗，經(jīng)過濾膜富集濃縮后，得到的結(jié)果更準確，從而更有利地發(fā)現(xiàn)內(nèi)鏡清洗消毒工作中存在的隱患[9]。本研究中，終末漂洗水、內(nèi)鏡消毒質(zhì)量細菌菌落數(shù)的監(jiān)測，均采用過濾集菌法完成。

MAREK等[10]報導，對內(nèi)鏡終末漂洗水的微生物水平應(yīng)給以有效的控制，水處理系統(tǒng)要定期進行衛(wèi)生處理及過氧乙酸消毒，并監(jiān)測細菌總數(shù)、假單胞菌、內(nèi)毒素、環(huán)境分支桿菌及軍團菌等。我國于2017年6月1日實施的《軟式內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》標準[7]，規(guī)定了消毒后的內(nèi)鏡應(yīng)采用純化水進行終末漂洗，且純化水菌落總數(shù)應(yīng)≤10 CFU/100 ml。近些年，國外的主流觀點傾向于使用低營養(yǎng)培養(yǎng)基、低溫和長時間培養(yǎng)檢測純化水的細菌水平，專家認為培養(yǎng)基營養(yǎng)過于豐富會抑制純化水中的異生細菌，從而降低檢出率，造成日常監(jiān)測的假陰性。本研究中，分別采用TGEA法（參照同屬于純化水的透析用水的檢測方法，20℃培養(yǎng)168 h）和營養(yǎng)瓊脂法（36℃培養(yǎng)48 h），來對比終末漂洗水的微生物水平，結(jié)果TGEA法檢出率和菌落數(shù)均高于營養(yǎng)瓊脂法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Bland-Altman圖顯示兩法差值、比值均較大、一致性較差。因此，筆者認為，高營養(yǎng)高溫（營養(yǎng)瓊脂法）培養(yǎng)可能屏蔽了純化水的真實微生物水平，使得終末漂洗作為內(nèi)鏡消毒處理程序的重要步驟直接影響了內(nèi)鏡的清洗消毒效果，使內(nèi)鏡在診療過程中存在潛在性風險。TGEA法低溫長時間培養(yǎng)用于終末漂洗水菌落計數(shù)，具有很好的臨床適應(yīng)性。

KIM等[11]報導，由于十二指腸鏡的結(jié)構(gòu)特殊，造成常規(guī)的清洗消毒不達標，從而導致患者間的多重耐藥細菌的傳播而引起爆發(fā)，解決方案除對內(nèi)鏡進行高水平消毒和滅菌處理，還包括加強對內(nèi)鏡消毒質(zhì)量的監(jiān)測。本研究參照《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》[6]，采用試劑盒過濾集菌法和傳統(tǒng)過濾集菌法進行內(nèi)鏡消毒效果微生物學監(jiān)測，結(jié)果檢出率、菌落數(shù)相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Bland-Altman圖顯示兩法差值、比值均較小，一致性好。軟式內(nèi)鏡細菌監(jiān)測采樣收集和培養(yǎng)系統(tǒng)-試劑盒過濾集菌的設(shè)計原理，是基于內(nèi)鏡消毒質(zhì)量監(jiān)測的全過程應(yīng)用（采樣+檢測），系統(tǒng)包括一次性無菌采樣瓶、一次性無菌灌注器（含無菌洗脫液）、一次性無菌檢測試劑盒和培養(yǎng)基，工作人員實際操作時，無需其他準備即可完成內(nèi)鏡消毒質(zhì)量監(jiān)測的全過程，具有操作簡單、快捷和高效的特點。采樣瓶、試劑盒、抽濾設(shè)備的接口均采用內(nèi)、外螺旋設(shè)計，抽濾過程添加無菌空氣過濾器，保證整個過濾集菌過程在無菌的條件下完成，故無需苛刻地檢測環(huán)境、設(shè)備及專業(yè)的微生物檢測人員操作，有很好的臨床適用性，甚至可以在內(nèi)鏡中心一并完成采樣、過濾集菌、培養(yǎng)和計數(shù)等鑒定手段，可便捷、準確地反應(yīng)內(nèi)鏡消毒質(zhì)量，保證內(nèi)鏡診療的安全進行。

對醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)鏡消毒質(zhì)量自檢水平、現(xiàn)狀的調(diào)查結(jié)果顯示，終末漂洗水自檢率僅為60.0%、內(nèi)鏡監(jiān)測使用國標規(guī)定的過濾集菌法僅占3.3%、使用國標規(guī)定量（50 ml）洗脫液灌洗內(nèi)鏡管道占33.3%，整體表現(xiàn)出監(jiān)測水平較低、采用的檢測方法規(guī)范性差的現(xiàn)狀。醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)加強檢驗員培訓，規(guī)范檢測方法，提高技術(shù)水平，確保內(nèi)鏡消毒質(zhì)量被準確評估和驗證。

綜上所述，選用規(guī)范的監(jiān)測方法，客觀地反應(yīng)內(nèi)鏡消毒質(zhì)量的真實情況，對內(nèi)鏡診療過程中的風險控制起著重要的做用。TGEA法低溫長時間培養(yǎng)用于終末漂洗水、試劑盒過濾集菌法用于內(nèi)鏡消毒質(zhì)量監(jiān)測應(yīng)被廣泛推廣。