張通 ，栗瑞蘭 ，范曉梅 ，劉春潔，海日汗，霍敏，張家新

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110）

0 引言

【研究意義】哺乳動(dòng)物胚胎體外生產(chǎn)效率低，很大程度上與卵母細(xì)胞和胚胎暴露于不利的體外培養(yǎng)環(huán)境中造成的氧化應(yīng)激有關(guān)[1-2]。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡是影響卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量以及胚胎發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素。近年的研究表明，原癌基因 SHC編碼的亞型 66KD線粒體氧化應(yīng)激蛋白（p66Shc）及其信號(hào)特性在調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和機(jī)體衰老過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3-4]。因此，如果能從卵母細(xì)胞入手，研究p66Shc基因調(diào)控卵母細(xì)胞線粒體氧化還原代謝機(jī)制，從基因角度探究改善胚胎抗氧化應(yīng)激能力的方法，從基因角度改善胚胎抗氧化應(yīng)激能力，這對(duì)于優(yōu)化家畜胚胎體外生產(chǎn)體系和提升人類輔助生殖技術(shù)水平具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】p66Shc作為少數(shù)確定的哺乳動(dòng)物氧化應(yīng)激調(diào)控基因之一。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，p66Shc基因缺失突變體能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)活性氧類物質(zhì)的抗性并延長(zhǎng)機(jī)體壽命[5]，還能抵制年齡相關(guān)的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化[6]，內(nèi)皮紊亂[7]，糖尿病依賴性腎小球病[8]和乙醇誘導(dǎo)的肝病[9]等。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎體外發(fā)育遲緩、阻滯很大程度上是由氧化應(yīng)激引起胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡所導(dǎo)致。有報(bào)道表明哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育阻滯與線粒體氧化應(yīng)激蛋白 p66Shc的表達(dá)有關(guān)[10-12]。REN等[13]表明，砷可以顯著誘導(dǎo)小鼠2-cell早期胚胎的發(fā)育阻滯和線粒體氧化應(yīng)激蛋白p66Shc的表達(dá)上調(diào)。通過(guò)顯微注射p66Shc的siRNA到小鼠的受精卵原核，結(jié)果導(dǎo)致p66Shc mRNA和蛋白水平以及活性氧水平的顯著下降，從而使砷誘導(dǎo)的2-cell阻滯減少，同時(shí)桑椹胚發(fā)育率得到提高。此外，BETTS等[14]在牛合子階段同樣利用p66Shc RNA干擾技術(shù)，數(shù)據(jù)表明p66Shc敲除的胚胎表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低、DNA損傷減少、錳過(guò)氧化物歧化酶（MnSOD）表達(dá)水平升高，胚胎發(fā)育至囊胚階段的比例升高。上述結(jié)果表明p66Shc敲除能夠顯著增加胚胎的氧化應(yīng)激抗性改善體外胚胎的發(fā)育能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量以及發(fā)育能力的獲得至關(guān)重要。p66Shc作為細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要感受蛋白，開(kāi)展探究p66Shc對(duì)綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制具有重要意義。但迄今報(bào)道關(guān)于p66Shc在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控的文獻(xiàn)較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究比較分析了成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞中 p66Shc mRNA和蛋白的表達(dá)規(guī)律、線粒體分布與活性、ROS水平以及氧化還原穩(wěn)態(tài)，為進(jìn)一步研究p66Shc調(diào)控綿羊卵母細(xì)胞氧化還原機(jī)制以及 p66Shc的功能提供重要的理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試劑與藥品

TCM-199培養(yǎng)液，含 Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, DPBS），青鏈霉素合劑（Penicillin-Streptomycin, PS）均為Gibco公司產(chǎn)品；促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）購(gòu)自Bioniche公司；雌二醇（E2）、胎牛血清（FBS）、透明質(zhì)酸酶（Hya）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯醇（PVA）、半胱胺均購(gòu)自Sigma公司；p66Shc兔源一抗和 Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔的二抗均購(gòu)自Proteintech公司，MitoTracker? Red CMXRos購(gòu)自Invitrogen公司；活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的采集與體外成熟 試驗(yàn)所用綿羊卵巢來(lái)源于呼和浩特屠宰場(chǎng)，用添加有青鏈霉素的滅菌生理鹽水清洗卵巢3次，然后放入37℃水浴鍋內(nèi)保溫。從卵巢表面抽取直徑為3—6 mm的卵泡，在體視顯微鏡下挑選卵母細(xì)胞。根據(jù)卵母細(xì)胞質(zhì)均勻程度、卵丘細(xì)胞形態(tài)及其與卵母細(xì)胞結(jié)合的緊密程度分為優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì)卵母細(xì)胞，優(yōu)質(zhì)（high quality, HQ）卵母細(xì)胞：形狀規(guī)則、胞質(zhì)均勻、色澤一致、卵丘細(xì)胞層包裹緊密完整（圖1-a）；劣質(zhì)（poor quality, PQ）卵母細(xì)胞：形狀規(guī)則，胞質(zhì)不均、色澤不一，卵丘細(xì)胞包裹不完整（圖 1-b）。選用優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞用于體外成熟，分為常規(guī)24 h成熟組 (圖1-c) 和成熟30 h老化組 (圖 1-d)。成熟培養(yǎng)液為：TCM-199+10% (v：v)FBS+1% (v：v) PS + 10 μg·mL-1FSH +10 μg·mL-1LH +1 μg·mL-1E2+100 nmol·L-1半胱胺。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分別收集成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞、劣質(zhì)卵母細(xì)胞、常規(guī)成熟24 h卵母細(xì)胞、老化組的卵母細(xì)胞，每組樣品收集卵母細(xì)胞數(shù)為50枚。按照RNeasy Mini kit (Qiagen)微量樣品總RNA提取試劑盒提取卵母細(xì)胞的總RNA，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并將所得cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank查找綿羊的 p66Shc序列和β-actin序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表 1，由上海生工合成，以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA作為模板，以SYBR為熒光染料，用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每組試驗(yàn)重復(fù) 3次。以 β-actin為內(nèi)參，根據(jù) 2-ΔΔCt計(jì)算p66Shc相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 線粒體染色和細(xì)胞免疫熒光 分別收集成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞、劣質(zhì)卵母細(xì)胞、常規(guī)成熟24 h卵母細(xì)胞、老化組的卵母細(xì)胞，渦旋處理以去除卵丘細(xì)胞。裸卵在含有0.01% PVA的PBS緩沖液中洗滌3次，轉(zhuǎn)入 500 nmol·L-1MitoTracker Red CMXRos（Cat＃M7512, Invitrogen, USA）孵育30 min，使用4%多聚甲醛室溫固定 15 min，將固定的卵母細(xì)胞在 0.1%Triton X-100的PBS中透化20 min，隨后在5%山羊血清中室溫封閉 1 h，將卵母細(xì)胞在 p66Shc兔源一抗（Proteintech）（1∶100）中4℃孵育過(guò)夜。將洗滌后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入二抗（Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔）孵育 30 min，用 1 μg·mL-1DAPI染色 15 min。將染色的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 35 mm的共焦皿中，并在 Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察。檢測(cè) p66Shc（Ex：495 nm; Em： 519 nm），MitoTracker Red（Ex： 578 nm;Em： 598 nm）和 DAPI（Ex： 359 nm; Em： 461 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.4 ROS檢測(cè) 分別收集成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞、劣質(zhì)卵母細(xì)胞、常規(guī)成熟24 h卵母細(xì)胞、老化組的卵母細(xì)胞各 30枚，渦旋處理以去除卵丘細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有200 μL 10 mmol·L-1ROS 水平檢測(cè)工作液（DCFH-DA)的平皿中，置于39℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，將染色的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 35 mm的共焦皿中，并在 Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察檢測(cè)FITC（Ex： 495 nm; Em： 519 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 氧化還原穩(wěn)態(tài)檢測(cè) 分別收集成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞、劣質(zhì)卵母細(xì)胞、常規(guī)成熟24 h卵母細(xì)胞、老化組的卵母細(xì)胞各30枚，渦旋處理以去除卵丘細(xì)胞，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35 mm的共焦皿中，并在Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察。檢測(cè)FAD++（Ex：490 nm; Em： 540 nm）和 NAD(P)H（Ex： 420 nm; Em：460 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)處理 收集成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞，分為對(duì)照組（30 min和 1 h）、處理組（100 μmol·L-1H2O2處理30 min和1 h），每組樣品20枚卵母細(xì)胞，首先比較對(duì)照組和處理組 ROS水平和氧化還原穩(wěn)態(tài)的變化，然后檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)p66Shc蛋白表達(dá)影響。將卵母細(xì)胞在p66Shc兔源一抗（Proteintech）（1： 100）中4℃孵育過(guò)夜。將洗滌后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入二抗（Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔）孵育30 min，用1μg·mL-1DAPI染色15 min。將染色的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35 mm的共焦皿中，并在Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)（Olympus, Tokyo, Japan）下觀察。檢測(cè)p66Shc（Ex： 495 nm; Em： 519 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

圖1 成熟前后不同質(zhì)量的綿羊卵母細(xì)胞Fig. 1 Different quality sheep oocytes before and after maturation

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件中的 ANAVO 進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 p66Shc在成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

如圖2所示，RT-qPCR試驗(yàn)分析結(jié)果表明，p66Shc在綿羊成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞p66Shc mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于同時(shí)期優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞（P＜0.05）。成熟后老化的卵母細(xì)胞p66Shc mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于常規(guī)成熟24 h的卵母細(xì)胞（P＜0.05）。然而優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟前后p66Shc mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 p66Shc在成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 The relative expression of p66Shc in different quality oocytes before and after maturation

2.2 p66Shc蛋白與線粒體在成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞的共定位

采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和 MitoTracker Red線粒體探針對(duì) p66Shc蛋白質(zhì)和線粒體在綿羊成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞進(jìn)行共定位，如圖3所示，p66Shc蛋白質(zhì)在綿羊成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，且主要呈現(xiàn)周邊定位并且集中在線粒體分布活躍的區(qū)域。成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞p66Shc蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（P＜0.05），成熟后老化的卵母細(xì)胞p66Shc蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著高于常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞（P＜0.05）。然而優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟后p66Shc蛋白表達(dá)顯著低于成熟前卵母細(xì)胞（P＞0.05）。成熟前卵母細(xì)胞線粒體在整個(gè)胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的周邊分布和中央彌散分布模式，成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞線粒體活性顯著高于成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞。優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞常規(guī)成熟后線粒體聚集在皮質(zhì)區(qū)域，然而老化卵母細(xì)胞的線粒體分布出現(xiàn)紊亂。

圖3 p66Shc蛋白與線粒體在成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞的共定位Fig. 3 Co-localization of p66Shc protein and mitochondria in different quality oocytes before and after maturation

表1 p66Shc和β-actin基因引物序列Table 1 The oligonucleotide primer for p66Shc and β-actin

2.3 成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞的ROS水平

利用熒光探針DCFH-DA對(duì)成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞的 ROS水平顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（P＜0.05），成熟后老化的卵母細(xì)胞的 ROS水平顯著高于常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞（P＜0.05），優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟后的 ROS水平顯著高于成熟前的卵母細(xì)胞（P＜0.05）。

圖4 不成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞的ROS水平Fig. 4 ROS levels of different quality oocytes before and after maturation

2.4 成熟前后不同質(zhì)量綿羊卵母細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)

通過(guò)檢測(cè)成熟前后不同質(zhì)量綿羊卵母細(xì)胞FAD++/NAD(P)H比率來(lái)評(píng)價(jià)胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)。結(jié)果如圖5所示，成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞的FAD++/ NAD(P)H比率顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（P＜0.05），成熟后老化卵母細(xì)胞的 FAD++/NAD(P)H比率顯著低于常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞（P＜0.05）。優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞成熟前后 FAD++/NAD(P)H比率沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖5 成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)Fig. 5 Redox homeostasis of different quality oocytes before and after maturation

2.5 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激上調(diào) p66Shc的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究p66Shc對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)，采用外源100 μmol·L-1H2O2處理成熟前優(yōu)質(zhì)綿羊卵母細(xì)胞，結(jié)果如圖 6所示，100 μmol·L-1H2O2處理 30 min和1 h誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激ROS水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖6-A），F(xiàn)AD++/NAD(P)H比率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05) (圖 6-B)。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光表明H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激顯著上調(diào)p66Shc蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，并且促使p66Shc由胞質(zhì)向細(xì)胞核定位（圖6-C、D）。

圖6 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激上調(diào) p66Shc的表達(dá)Fig. 6 Hydrogen peroxide induced oxidative stress upregulated the expression of p66Shc

3 討論

活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）主要包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥基自由基（HO·）等，這些都是氧化損傷的有效誘導(dǎo)劑并且參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，例如生殖細(xì)胞老化與凋亡、早期胚胎發(fā)育阻滯等[15-17]。有報(bào)道研究表明，體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中由于配子和胚胎暴露在外部環(huán)境下，內(nèi)源性和外源性高水平的 ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致基因表達(dá)和表觀遺傳修飾的改變以及細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量差、早期植入前胚胎的發(fā)育阻滯和凋亡[18-19]。

p66Shc作為少數(shù)確定的哺乳動(dòng)物氧化應(yīng)激調(diào)控基因之一，在調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激方面，主要表現(xiàn)為參與破壞線粒體的代謝網(wǎng)絡(luò)、引起細(xì)胞色素c的釋放和caspase的級(jí)聯(lián)活化[20-22]。因而從基因角度說(shuō)，p66Shc介導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵基因。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)是保證卵母細(xì)胞正常成熟和胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵性因素。在本研究中，從 mRNA和蛋白兩個(gè)水平對(duì)綿羊成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激蛋白p66Shc mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了比較分析。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明，p66Shc基因在成熟前劣質(zhì)和成熟后老化卵母細(xì)胞 p66Shc mRNA的相對(duì)表達(dá)量都顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)和常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞，然而優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞常規(guī)成熟前后沒(méi)有顯著差異（圖 2）。FAVETTA等[23]對(duì)氧化應(yīng)激蛋白 p66Shc在正常發(fā)育與早期發(fā)育阻滯的牛胚胎表達(dá)的研究中，發(fā)現(xiàn)p66Shc mRNA在成熟前后的牛卵母細(xì)胞中表達(dá)沒(méi)有顯著差異，這與本研究的結(jié)果相似。BAIN等[11]在牛胚胎中發(fā)現(xiàn)胚胎質(zhì)量差與p66Shc氧化應(yīng)激蛋白高表達(dá)有關(guān)，因此推測(cè)p66Shc基因參與調(diào)控卵母細(xì)胞和早期胚胎氧化應(yīng)激的能力。利用細(xì)胞免疫熒光結(jié)合MitoTracker Red探針對(duì)p66Shc和線粒體進(jìn)行共定位，結(jié)果表明成熟前劣質(zhì)和成熟后老化卵母細(xì)胞 p66Shc的蛋白表達(dá)顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)和常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞，這與mRNA表達(dá)模式一致（圖 3）。線粒體作為卵母細(xì)胞和胚胎能量代謝的核心，在卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育期間的各種生物過(guò)程中起重要作用，越來(lái)越多的證據(jù)表明細(xì)胞質(zhì)線粒體的區(qū)域再分布以及活性大小能夠作為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力的決定因素[24-25]。本研究中，比較分析了成熟前后不同質(zhì)量綿羊卵母細(xì)胞線粒體的分布與活性，成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)周邊聚集和胞質(zhì)的彌散分布模式（圖 3），這可能與成熟過(guò)程中的卵母細(xì)胞與外界能量交換密切對(duì)線粒體需求較多有關(guān)，成熟前劣質(zhì)卵母細(xì)胞線粒體的活性顯著低于優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞（圖3）。常規(guī)成熟24 h的卵母細(xì)胞線粒體更多地聚集到卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)域，這可能與卵母細(xì)胞為受精做準(zhǔn)備有關(guān)，然而成熟30 h的卵母細(xì)胞線粒體分布模式紊亂（圖3）?？傊?，本研究的結(jié)果顯示，p66Shc表達(dá)水平的高低與線粒體的分布和活性反應(yīng)了成熟前后卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

卵母細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，ROS的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。由于種種原因，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)度產(chǎn)生而ROS清除能力下降，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激[26]。p66Shc對(duì)線粒體ROS代謝的調(diào)節(jié)依賴于線粒體呼吸鏈。研究發(fā)現(xiàn)p66Shc基因敲除小鼠的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著降低，同時(shí)檢測(cè)到反映細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要標(biāo)志物—8-氧代脫氧鳥(niǎo)苷和硝基酪氨酸的下降[27]。為了進(jìn)一步探究成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞p66Shc與ROS水平和氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)系，筆者利用熒光探針DCFH-DA和卵母細(xì)胞自發(fā)熒光分別對(duì)成熟前后不同質(zhì)量卵母細(xì)胞內(nèi) ROS水平和氧化還原穩(wěn)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明成熟前劣質(zhì)和成熟后老化卵母細(xì)胞 ROS水平分別顯著高于成熟前優(yōu)質(zhì)和常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞（圖4），因此，卵母細(xì)胞質(zhì)量差很大成程度上與ROS代謝失衡有關(guān)。TAKAHASHI等[28]同樣發(fā)現(xiàn)質(zhì)量差的小鼠卵母細(xì)胞 ROS水平顯著高于正常的卵母細(xì)胞。FAD++/NADH熒光強(qiáng)度比稱之為氧化還原比，常用來(lái)確定細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的相對(duì)變化來(lái)反映細(xì)胞代謝狀態(tài)的變化[29-30]。與成熟前優(yōu)質(zhì)和常規(guī)24 h成熟的卵母細(xì)胞相比，成熟前劣質(zhì)和成熟后老化卵母細(xì)胞表現(xiàn)出氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的狀態(tài)（圖5）。因此，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降與ROS水平升高及氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。過(guò)氧化氫（H2O2）被廣泛用作外源 ROS的來(lái)源誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[31-32]，采用外源 100μmol·L-1H2O2分別誘導(dǎo)成熟前優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞30 min和1 h，結(jié)果表明H2O2處理引起ROS顯著上升和氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡，并且 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激顯著上調(diào)p66Shc蛋白表達(dá)并促使 p66Shc由胞質(zhì)向細(xì)胞核定位（圖6）。因此，p66shc在氧化應(yīng)激條件下的表達(dá)上調(diào)，可能觸發(fā)了卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激“閘門(mén)”的開(kāi)啟。但 p66shc對(duì)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

p66Shc在劣質(zhì)和老化的綿羊卵母細(xì)胞中呈現(xiàn)高水平的表達(dá)特征，而且p66Shc高表達(dá)影響了綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)。