李文楊，劉遠(yuǎn)，吳賢鋒，高承芳，黃勤樓

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

0 引言

【研究意義】繁殖性能是養(yǎng)羊業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)性狀，能繁母羊產(chǎn)仔數(shù)的多少直接影響?zhàn)B羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。由于羊繁殖性狀受到遺傳力低、限性性狀等因素制約，常規(guī)選育存在周期長、遺傳進(jìn)展慢的缺點(diǎn)，最經(jīng)濟(jì)有效的方法是通過選擇控制多胎性能的主效基因（分子標(biāo)記）提高母羊的產(chǎn)羔率[1-2]。因此研究羊繁殖性狀的分子調(diào)控機(jī)理，挖掘、鑒定和充分利用控制羊繁殖性狀的主效基因，并應(yīng)用于羊繁殖性狀的遺傳改良具有重要意義[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一環(huán)境或生理?xiàng)l件下所轉(zhuǎn)錄表達(dá)的所有 RNA總和，是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組生物功能的紐帶[4]。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）的發(fā)展和成熟為系統(tǒng)研究基因表達(dá)及調(diào)控提供了重要的手段和方法，在畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀分子機(jī)制研究中得到了廣泛使用[5-7]。基于高通量測序技術(shù)，研究者采用不同的策略開展了羊繁殖性狀候選基因的篩選與鑒定。羅慶苗等[8]利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)（digital gene expression tag profiling，DGE）分別檢測了處于自然發(fā)情期的 FecBBFecBB型與FecB+FecB+型小尾寒羊卵巢組織的基因表達(dá)情況，認(rèn)為類固醇快速調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）、卵巢濾泡激素（Folliculin，F(xiàn)LCN）等5個(gè)基因與Notch信號(hào)通路可能是參與調(diào)控小尾寒羊高低繁殖性狀差異的重要基因和調(diào)控通路。DI等[9]利用 RNA-Seq技術(shù)獲得了綿羊不同繁殖狀態(tài)下的基因表達(dá)模式。LING等[3]比較了發(fā)情期多羔和單羔安徽白山羊卵巢組織的差異表達(dá)情況，篩選出了12個(gè)可能與山羊高繁殖力有關(guān)的基因。FENG等[10]研究了高產(chǎn)和低產(chǎn)湖羊卵泡期卵巢組織 RNA表達(dá)差異，篩選出了 76個(gè)差異表達(dá)基因和 5個(gè)差異表達(dá)長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）。付紹印等[11]對(duì)巴美肉羊性腺軸進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，功能富集分析表明，神經(jīng)活性的配體-受體相互作用信號(hào)通路在下丘腦-垂體-卵巢性腺軸調(diào)控排卵及卵泡發(fā)育方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)部分綿羊、山羊品種的繁殖力相關(guān)基因研究較多，但對(duì)福清山羊的相關(guān)研究較少。而影響不同品種繁殖力的基因也不盡相同，李文楊等[12]證實(shí)控制部分綿羊、山羊多胎性狀主效基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR-1B）和生長分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）并非控制福清山羊繁殖性狀的主效基因。努比亞黑山羊母羊繁殖指數(shù)（dam reproduction index，DRI）高達(dá)0.99，而福清山羊母羊DRI僅為0.45[13]。同時(shí)有研究表明利用努比亞黑山羊改良貴州黑山羊可提高后者產(chǎn)羔率37.2%[14]。因此，導(dǎo)入努比亞黑山羊基因改良福清山羊品種，對(duì)其繁殖、生產(chǎn)性能的提高具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以福建地方山羊品種——福清山羊和福建省引進(jìn)的努比亞黑山羊?yàn)椴牧?，采用RNA-Seq技術(shù)比較發(fā)情期卵巢組織的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs）及新轉(zhuǎn)錄本分析，并對(duì)篩選的DEGs進(jìn)行GO（gene ontology）、KEGG（kyoto encyclopediaof genes and genomes）功能富集和COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）分類，挖掘控制福清山羊繁殖性能的相關(guān)候選基因，一方面為地方品種種質(zhì)資源的遺傳機(jī)制研究提供理論依據(jù)，另一方面通過測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)，篩選潛在可能影響福清山羊繁殖性能的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）和插入缺失標(biāo)記（insertion-deletion，InDel）分子遺傳標(biāo)記，為福清山羊繁殖性能分子遺傳改良提供新的育種素材。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用的福清山羊和努比亞黑山羊由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院福清市漁溪肉羊試驗(yàn)基地提供，試驗(yàn)于2017年2—6月進(jìn)行。選擇2—3歲營養(yǎng)良好、體態(tài)勻稱的空懷雌性福清山羊和努比亞黑山羊各5只。母羊發(fā)情鑒定以公羊試情為主，結(jié)合母羊外陰部觀察。試情公羊每日早晚各試情 1次（早 9：00、晚 21：00），母羊連續(xù)2次試情均接受試情公羊的爬跨，并在爬跨時(shí)靜立不動(dòng)即鑒定為發(fā)情。鑒定母羊發(fā)情后按照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理飼喂準(zhǔn)則屠宰，取有成熟卵泡發(fā)育一側(cè)的卵巢組織，置于-80℃?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)品種屠宰3只，福清山羊標(biāo)記為F-1、F-2、F-3，努比亞黑山羊分別標(biāo)記為 N-4、N-5、N-6。

1.2 RNA提取、轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序

利用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit （TaKaRa，大連寶生物）提取每個(gè)樣品卵巢組織的總 RNA，單個(gè)建池。為了保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，采用Nanodrop檢測RNA的純度，Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。RNA樣品檢測合格后，送北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建以及測序。文庫構(gòu)建完成后，對(duì)建成文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測。文庫質(zhì)量合格后，不同的文庫利用 Illumina HiSeq2500平臺(tái)（Illumina，America），基于邊合成邊測序（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)進(jìn)行高通量測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理與分析

原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過去除含有接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾后獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。利用 TopHat2[15]軟件將獲得的 Clean reads比對(duì)到山羊參考基因組（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/ GCF/001/704/415/GCF_001704415.1_ASM170441v1/GCF_001704415.1_ASM 170441v1_genomic.fna.gz）[16]，獲取序列在參考基因組或基因上的位置信息，以及樣品特有的序列特征信息。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選、功能注釋和富集分析

參考JIANG等報(bào)道的數(shù)學(xué)模型[17]，使用Cufflinks軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量。采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)[18]。皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)[19]。

以福清山羊?yàn)閷?duì)照，利用DEseq進(jìn)行2個(gè)品種間的差異表達(dá)分析[20]。將差異倍數(shù)≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）＜0.01作為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。繪制2個(gè)品種DEGs火山圖并進(jìn)行聚類分析。分別利用GO數(shù)據(jù)庫[21]、COG數(shù)據(jù)庫[22]和KEGG數(shù)據(jù)庫[23]對(duì)DEGs進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.5 SNP/InDel分析

基于各樣品 reads與參考基因組序列的 TopHat2比對(duì)結(jié)果，使用 GATK軟件[24]識(shí)別測序樣品與參考基因組建的單堿基錯(cuò)配和插入缺失，識(shí)別潛在的SNP及 InDel位點(diǎn)。進(jìn)一步利用 SnpEff軟件[25]注釋篩選到的變異（SNP、InDel）和預(yù)測變異造成的影響。

1.6 熒光定量PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測序結(jié)果以及發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本序列的準(zhǔn)確性，以18S rRNA為內(nèi)參基因，隨機(jī)挑選6個(gè) DEGs和2個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證基因表達(dá)量。內(nèi)參基因引物參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[21]，其余基因和新轉(zhuǎn)錄本引物根據(jù)測序序列信息由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)，鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，基因名稱及引物信息見表1。以1.2中各樣品RNA池為模板，采用TAKARA PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連寶生物）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各 1μL，2×SYBR? Select Master Mix 10μL，ddH2O7μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸40s，50個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 5min；4℃保存。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Table 1 The qRT-PCR primers

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)評(píng)估及對(duì)比分析

經(jīng)過文庫質(zhì)量檢測和測序質(zhì)量控制，各樣品均符合測序要求。6個(gè)樣品共得到46.68Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達(dá)到7.24Gb以上，獲得Clean reads 24 283 922—27 945 197條。測序數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量（Quality Score）Q30堿基百分比為91.15%—91.99%，堿基GC含量為50.98%—52.19%，各堿基質(zhì)量穩(wěn)定在20%—30%之間，低質(zhì)量堿基比例小，測序質(zhì)量好。表明文庫構(gòu)建質(zhì)量和測序質(zhì)量高，測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，滿足后續(xù)分析條件。

將獲得的 Clean reads與參考山羊基因組進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明各樣品的 Clean reads與參考基因組的比對(duì)效率在 84.62%—87.14%之間，比對(duì)到參考基因組唯一位置的Reads占Clean Reads的百分比為 81.28%—84.35%，多處位置的百分比為2.30%—3.71%（表2），表明6個(gè)樣本總RNA不存在污染。

表2 測序數(shù)據(jù)與參考基因組的序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 RNA-Seq and mapping to the reference genome

2.2 DEGs的篩選、功能注釋和富集分析

2.2.1 DEGs的篩選 通過定位到參考基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的Reads的計(jì)數(shù)來估計(jì)基因（轉(zhuǎn)錄本）的表達(dá)水平，基因（轉(zhuǎn)錄本）的真實(shí)表達(dá)水平與Reads計(jì)數(shù)、基因（轉(zhuǎn)錄本）的長度和測序深度成正相關(guān)。采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，計(jì)算得到了6個(gè)樣本18 996個(gè)表達(dá)基因的FPKM值。

為了保證測序數(shù)據(jù)的可重復(fù)性以及可靠性，分析了6個(gè)樣品之間轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的相關(guān)性。皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方（r2）越接近于1，說明2個(gè)樣品的表達(dá)模式相似度越高。Encode計(jì)劃建議r2大于0.92，福清山羊3個(gè)樣品的r2為0.926—0.935，努比亞黑山羊3個(gè)樣品的r2為0.928—0.947，表明2個(gè)品種內(nèi)部樣品之間表達(dá)模式的相似度較高，重復(fù)性好，試驗(yàn)結(jié)果可信度高。

根據(jù)差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，以福清山羊?yàn)閷?duì)照，獲得了努比亞黑山羊和福清山羊發(fā)情期卵巢組織的DEGs 149個(gè)，其中上調(diào)基因53個(gè)，下調(diào)基因96個(gè)，圖2為DEGs火山圖。進(jìn)一步根據(jù)DEGs在2個(gè)品種卵巢組織的差異表達(dá)值和文獻(xiàn)檢索，初步認(rèn)為輸卵管素基因（oviductin，OVN）、類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein，STAR)、早期生長應(yīng)答1基因(early growth response 1，EGR1)可作為福清山羊繁殖性能的候選基因。

圖1 樣品的表達(dá)量相關(guān)性熱圖Fig. 1 Correlation heat map of gene expression level in 6 samples

2.2.2 DEGs的GO功能富集 GO注釋系統(tǒng)是一個(gè)有向無環(huán)圖，包含生物學(xué)過程（biological process,BP），細(xì)胞組分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）3個(gè)主要分支。篩選出的149個(gè)DEGs中的108個(gè)基因能夠被GO數(shù)據(jù)庫注釋（圖3）。被注釋的DEGs分別參與了BP、CC和MF的22、19和20個(gè)功能亞分類。在BP分類中，細(xì)胞過程、單一的生物過程和生物調(diào)節(jié)參與的DEGs最多，與繁殖相關(guān)聯(lián)的繁殖過程和繁殖的DEGs也被注釋。在CC分類中，參與細(xì)胞部分；2細(xì)胞；3細(xì)胞器的DEGs最多。在MF分類中，DEGs在結(jié)合中所占比例最高，其次為催化活性及分子傳感器活性。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed genes

圖3 差異表達(dá)基因GO注釋Fig. 3 GO annotation of DEGs

2.2.3 差異表達(dá)基因的COG分類 利用COG數(shù)據(jù)庫可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。篩選出的149個(gè)DEGs中，有30個(gè)DEGs能夠被COG數(shù)據(jù)庫注釋，分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖 4。其中一般的功能預(yù)測基因數(shù)目最多，其次為脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝。

2.2.4 差異表達(dá)基因的KEGG注釋 經(jīng)過分析，可被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的91個(gè)DEGs參與了多個(gè)代謝通路，將差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，分類圖見圖 5。差異表達(dá)基因參與最多的是人類疾病相關(guān)的通路，其次是生物系統(tǒng)相關(guān)通路和環(huán)境信息處理相關(guān)通路。

以KEGG數(shù)據(jù)庫總通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在DEGs中顯著性富集的通路，KEGG通路分析表明DEGs共富集到21條信號(hào)通路中，6條通路顯著富集（P＜0.05）。圖 6為DEGs的KEGG通路富集分析結(jié)果，圖中呈現(xiàn)了顯著性Q值最小的20個(gè)通路，其中自身免疫性甲狀腺病、同種異體移植排斥、吞噬體、病毒性心肌炎、哮喘 5個(gè)代謝通路的富集顯著性最可靠，推測其相關(guān)的DGEs可能與山羊繁殖性能相關(guān)。

圖4 差異表達(dá)基因COG注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig. 4 COG annotation classification statistics of DEGs

2.3 新基因分析

使用Cufflinks軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接，并與參考基因組注釋信息進(jìn)行比較，尋找原來未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)，發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因，補(bǔ)充和完善參考基因組注釋信息。過濾掉編碼的肽鏈過短（少于 50個(gè)氨基酸殘基）或只包含單個(gè)外顯子的序列，共發(fā)掘1 506個(gè)新基因（轉(zhuǎn)錄本），其中25個(gè)在2個(gè)品種中差異表達(dá)。

2.4 SNP/InDel分析

經(jīng)過與參考基因組序列的對(duì)比，已知的 124個(gè)DEGs中發(fā)現(xiàn)了3 689個(gè)SNP/InDel位點(diǎn)，其中6個(gè)DEGs未發(fā)現(xiàn)突變（圖7）。位于內(nèi)含子區(qū)域（INTRON）的 SNP/InDel位點(diǎn)最多，占基因序列突變總量的43.2%，其次為下游序列（DOWNSTREAM），占比16.8%。而引起基因編碼序列非同義突變（NONSYNONYMOUS-CODING）的 SNP/InDel位點(diǎn)占比7.8%。

圖5 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Fig. 5 List of KEGG pathway for DEGs

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證測序

6個(gè)基因（轉(zhuǎn)錄本）的 qRT-PCR結(jié)果見圖8，選擇的目的基因在2個(gè)品種個(gè)體間表達(dá)變化模式與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得差異表達(dá)基因以及新基因（轉(zhuǎn)錄本）序列數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確。

圖6 差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig. 6 Enriched scatter map of DEGs KEGG pathway

圖8 測序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 8 Validation of sequencing results by qRT-PCR

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，動(dòng)物遺傳學(xué)從以前候選基因、單一性狀為主的微觀研究轉(zhuǎn)向以物種進(jìn)化構(gòu)架內(nèi)的全基因組水平、多性狀、組學(xué)化的宏觀研究，利用高通量測序技術(shù)研究畜禽主要經(jīng)濟(jì)性狀取得了較大的研究進(jìn)展[26]。卵巢是雌性動(dòng)物重要的繁殖器官，具有提供卵細(xì)胞和產(chǎn)生類固醇激素的功能，常用于發(fā)情和排卵等繁殖生理過程的研究。羅慶苗等[8]利用 DGE技術(shù)研究了小尾寒羊高繁殖性狀相關(guān)基因，但篩選的DEGs直接與已知?jiǎng)游锓敝承誀钕嚓P(guān)基因極少，DI等[9-10]在不同品種研究中也得到了類似結(jié)果，與本研究結(jié)果一致，并且不同品種篩選出的與繁殖性狀相關(guān)的DEGs也不盡相同。蘭道亮等[27]認(rèn)為部分DEGs可能涉及卵巢的相關(guān)功能及活動(dòng)，但缺乏現(xiàn)有試驗(yàn)驗(yàn)證；同時(shí)可能也與器官功能的復(fù)雜性和多樣性有關(guān)[8，28]。

Ovn具有促進(jìn)受精和早期胚胎發(fā)育的作用[29]，張譯夫等[30]研究表明其還在卵母細(xì)胞成熟和排卵過程中具有重要的生物學(xué)作用。Ovn的合成受卵巢類固醇激素的調(diào)控[31]，STAR編碼的蛋白通過增強(qiáng)膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮在類固醇激素合成的急性調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[32]，羅慶苗等[8]研究認(rèn)為STAR的顯著下調(diào)可導(dǎo)致 FecBBFecBB小尾寒羊性激素合成能力下降而提高繁殖力。本研究發(fā)現(xiàn)，與福清山羊?qū)Ρ?，努比亞黑山羊發(fā)情期卵巢組織的Ovn表達(dá)量顯著上調(diào)，而STAR表達(dá)量顯著下調(diào)，很可能是造成2品種繁殖性能差異的關(guān)鍵因素之一。EGR1涉及不同組織多種基因的反式激活及功能調(diào)控，在牛的排卵前卵泡中EGR1具有促性腺激素依賴性的誘導(dǎo)表達(dá)[33]，吳陽升等[34]研究表明EGR1參與綿羊卵泡早期發(fā)育功能，本研究中該基因顯著上調(diào)表達(dá)，可作為福清山羊繁殖性能候選基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證研究。此外，其他 DEGs（包括新轉(zhuǎn)錄本）與繁殖性能相關(guān)的確切功能及作用尚不明確，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

由于針對(duì)不同羊品種 RNA-Seq篩選到的 DEGs存在差異，對(duì)應(yīng)差異表達(dá)基因KEGG顯著富集到的代謝通路也不盡相同[9-11]。羅慶苗等[8]在小尾寒羊中富集到細(xì)胞內(nèi)吞過程、Notch信號(hào)通路和嘧啶代謝3個(gè)調(diào)控通路，LING等[3]在安徽白山羊繁殖力差異研究中富集到細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、粘著斑和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等11條信號(hào)通路，本研究富集到自身免疫性甲狀腺病、同種異體移植排斥、吞噬體、病毒性心肌炎、哮喘等免疫和人類疾病的代謝通路，與蘭道亮等[27,35-36]的研究結(jié)果相似，MIAO 等[35]認(rèn)為疾病相關(guān)通路的富集表明代謝、免疫等途徑可能調(diào)控家畜繁殖力，蘭道亮等[27]則認(rèn)為DEGs富集的疾病通路雖然源于疾病發(fā)生的生理過程，但這些通路中的部分基因可能涉及卵巢的相關(guān)功能及活動(dòng)。表明畜禽繁殖性能形成的分子機(jī)理其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，造成不同品種間高繁殖力差異的調(diào)控基因可能存在差異。

繁殖性狀是羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，而繁殖性狀是受多基因控制的，遺傳力低，傳統(tǒng)的選擇方法對(duì)其遺傳進(jìn)展的改良非常緩慢，利用顯著影響羊繁殖性能的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇能提高選育效果[29]。但研究表明分子標(biāo)記具有品種特異性，因此在不同品種中篩選出更豐富、更適用的分子標(biāo)記是當(dāng)前的重要工作之一 。RNA-Seq高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在完善基因結(jié)構(gòu)及挖掘新轉(zhuǎn)錄本及新基因方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)[27]。本研究發(fā)掘了1 506個(gè)新基因（轉(zhuǎn)錄本），其中25個(gè)為2個(gè)品種的差異表達(dá)基因。經(jīng)過進(jìn)一步與參考基因組序列的對(duì)比，在已知的 124個(gè) DEGs中發(fā)現(xiàn)了 3689個(gè)SNP/InDel位點(diǎn)，引起基因編碼序列非同義突變（NON-SYNONYMOUS-CODING）的 SNP/InDel位點(diǎn)占比7.8%，驗(yàn)證這些潛在影響福清山羊繁殖性能的分子標(biāo)記、評(píng)價(jià)其在福清山羊群體中的遺傳效應(yīng)，篩選出控制福清山羊繁殖性狀的主效基因（分子標(biāo)記）是下一步研究的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)DRI指數(shù)存在明顯差異的福清山羊和努比亞黑山羊的發(fā)情期卵巢組織進(jìn)行 RNA-Seq分析，在轉(zhuǎn)錄組水平上篩選出了可能與羊繁殖性能的149個(gè)DGEs，并發(fā)掘了1 506個(gè)新基因（轉(zhuǎn)錄本）。初步認(rèn)為OVN、STAR、EGR1在福清山羊和努比亞黑山羊發(fā)情期卵巢組織中的差異表達(dá)可能是造成2品種繁殖力差異的關(guān)鍵因素之一，可作為福清山羊繁殖性能的候選基因進(jìn)行深入驗(yàn)證研究。該研究為揭示福清山羊繁殖性能形成的分子機(jī)制提供了線索，為開發(fā)和利用畜禽優(yōu)良性狀分子標(biāo)記提供了參考依據(jù)。