肖瑤 楊梅 陳紅

(成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610045)

滴眼劑是指由原料藥物與適宜輔料制成的供滴入眼內(nèi)的無(wú)菌液體制劑[1]。國(guó)內(nèi)滴眼劑常為多劑量制劑，開(kāi)瓶后一般可使用4周，加入適當(dāng)抑菌劑是保證安全使用的關(guān)鍵。通過(guò)分析國(guó)內(nèi)滴眼劑說(shuō)明書(shū)發(fā)現(xiàn)，僅部分說(shuō)明書(shū)標(biāo)注了所用抑菌劑種類(lèi)，而標(biāo)明其含量的則更少。本試驗(yàn)收集樣品40批，包括抗生素滴眼液、抗病毒滴眼液、緩解視疲勞滴眼液等，主要含抑菌劑為羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞。

目前，滴眼劑中抑菌劑的檢查方法常為HPLC法，待測(cè)滴眼劑種類(lèi)較少，且不同滴眼劑測(cè)定方法不一致，測(cè)定的抑菌劑種類(lèi)也較少[2]。為了高通量快速分析各種滴眼劑中的抑菌劑，本試驗(yàn)建立了UPLC/MS/MS法定量分析滴眼劑中6種抑菌劑(羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞),有助于快速篩查滴眼劑所含抑菌劑種類(lèi)及定量。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Waters Xevo TQ MS串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，Milli-Q純水器(美國(guó)Millipore公司)。

羥苯甲酯(含量99.6%，批號(hào)：100278-201103)，羥苯乙酯(含量99.9%，批號(hào)：100847-201604)，羥苯丙酯(含量99.6%，批號(hào)：100444-201102)，苯甲酸(含量100.0%，批號(hào)：100419-201302)，均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；山梨酸(含量99.4%，批號(hào)：40124)，硫柳汞(含量99.2%，批號(hào)：40707)，均來(lái)源于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇、甲酸為色譜純市售試劑，其余試劑試藥為分析純；試驗(yàn)用水為Milli-Q水。樣品為市售滴眼劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×100mm, 1.7μm)；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.4mL/min；流動(dòng)相A：含0.05%甲酸的2.5mmol/L醋酸銨溶液，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

離子源及掃描方式：電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電離電壓：3.5kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：550L/h(氮?dú)?；錐孔反吹氣流量：50L/h(氮?dú)?；碰撞室壓力：4.01×10-3mbar(碰撞氣為氬氣)[3-4]。6種抑菌劑MRM參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件Tab.1 Gradient mobile phase for UPLC

2.2 溶液配制

供試品溶液的制備：對(duì)于含尼泊金酯類(lèi)的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至50mL，搖勻，作為供試品溶液；對(duì)于含苯甲酸的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至1mL，搖勻，作為供試品溶液；對(duì)于含山梨酸的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至10mL，搖勻，作為供試品溶液；對(duì)于含硫柳汞的樣品，精密移取100μL，加水稀釋至1mL，搖勻，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)取6種抑菌劑對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度約為1mg/mL的貯備液。分別精密量取羥苯甲酯、羥苯乙酯貯備液適量，加水稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?00、200、50、20、10和2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液；精密量取羥苯丙酯貯備液適量，加水稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?00、200、100、80、50和20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液；精密量取苯甲酸貯備液適量，加水稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?5、10、2.5、1、0.5和0.1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液；精密量取山梨酸貯備液適量，加水稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?00、40、10、4、2和0.4μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液；精密量取硫柳汞貯備液適量，加水稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?0、8、5、2.5、1和0.75μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取不含抑菌劑的空白樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件試驗(yàn)，基質(zhì)無(wú)干擾。另取不含抑菌劑的樣品作為空白溶液，加入適量羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸、硫柳汞對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件試驗(yàn)，在全掃描模式下的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，定量離子對(duì)MRM色譜圖見(jiàn)圖2。羥苯甲酯、苯甲酸、山梨酸保留時(shí)間約0.9min，羥苯乙酯保留時(shí)間約1.1min，羥苯丙酯保留時(shí)間約1.3min，硫柳汞保留時(shí)間約1.4min。在MRM模式下6種抑菌劑能良好分離，測(cè)定無(wú)干擾。

表2 6種抑菌劑MRM參數(shù)Tab.2 The parameters of MRM of six preservatives

3.2 線(xiàn)性與范圍

精密量取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果表明，羥苯甲酯、羥苯乙酯在0.002～0.5μg/mL范圍內(nèi)、羥苯丙酯在0.02～0.5μg/mL范圍內(nèi)、苯甲酸在0.1～25μg/mL范圍內(nèi)、山梨酸在0.4～100μg/mL范圍內(nèi)、硫柳汞在0.75～10μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與檢測(cè)濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系良好(r≥0.995)(表3)。

圖1 空白樣品加標(biāo)總離子流色譜圖Fig.1 TIC of the spiked sample

圖2 6種抑菌劑定量離子對(duì)MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs of six preservatives

表3 6種抑菌劑線(xiàn)性結(jié)果Tab.3 The results of linear regression of six preservatives

3.3 回收率試驗(yàn)

取不含抑菌劑的空白溶液9份，按“2.2”項(xiàng)下制備低、中、高3種濃度的溶液，各3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，羥苯甲酯平均回收率100.0%(RSD=4.0%)、羥苯乙酯平均回收率103.8%(RSD=3.4%)、羥苯丙酯平均回收率94.7%(RSD=4.1%)、苯甲酸平均回收率96.8%(RSD=3.0%)、山梨酸平均回收率105.0%(RSD=4.1%)、硫柳汞平均回收率104.7%(RSD=2.3%)。

3.4 定量限

取不含抑菌劑的空白溶液，加入各對(duì)照品溶液適量，按“2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按信噪比S/N≥10計(jì)算定量限。帶入稀釋倍數(shù)后，滴眼劑樣品中羥苯甲酯、羥苯乙酯的定量限為1μg/mL；羥苯丙酯的定量限為10μg/mL；苯甲酸的定量限為1μg/mL；山梨酸的定量限為40μg/mL；硫柳汞的定量限為8μg/mL。

3.5 進(jìn)樣重復(fù)性

取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD。羥苯甲酯(進(jìn)樣濃度0.2μg/mL)為1.1%；羥苯乙酯(進(jìn)樣濃度0.2μg/mL)為2.1%；羥苯丙酯(進(jìn)樣濃度0.2μg/mL)為2.1%；苯甲酸(進(jìn)樣濃度10μg/mL)為1.5%；山梨酸(進(jìn)樣濃度40μg/mL)為1.7%；硫柳汞(進(jìn)樣濃度2.5μg/mL)為2.2%。

3.6 樣品測(cè)定

采用建立的方法對(duì)42批滴眼液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

相同濃度下，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯甲酸、山梨酸在負(fù)離子模式下的響應(yīng)均強(qiáng)于正離子模式，故選擇負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。硫柳汞分子量為405.99，失鈉后為383，本試驗(yàn)以[M-Na]-為母離子采用負(fù)離子模式進(jìn)行分析。

本次試驗(yàn)樣品批次中有35%樣品未標(biāo)示抑菌劑種類(lèi)，標(biāo)示抑菌劑種類(lèi)的樣品中有29%無(wú)抑菌劑標(biāo)示量。而中國(guó)藥典2015年版四部[1]和美國(guó)藥典[5]均要求多劑量眼用制劑應(yīng)在產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)明抑菌劑種類(lèi)和標(biāo)示量。由此可見(jiàn)應(yīng)加強(qiáng)規(guī)范企業(yè)說(shuō)明書(shū)。

本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分滴眼液中抑菌劑實(shí)測(cè)百分含量偏低，分析原因可能是在長(zhǎng)期放置過(guò)程中抑菌劑存在降解的可能，導(dǎo)致抑菌劑檢出含量低于標(biāo)示量。這也與企業(yè)在滴眼劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究中往往關(guān)注含量測(cè)定與有關(guān)物質(zhì)檢查等，未重視抑菌劑穩(wěn)定性研究相關(guān)。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.4 The results of sample determination