張鵬云，李 蓉*，陳麗斯，林淑綿，楊 芳，張 峰

（1.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528400；2.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 中山 528458；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176）

葛根（Pueraria Radix）是豆科植物野葛（P. lobata Willd. Ohwi）的干燥根，主要種植于我國河南、河北、湖南、遼寧、廣東、浙江等地[1]。葛根含有豐富的淀粉、膳食纖維、糖類等物質(zhì)，還含有多種黃酮類化合物，如大豆素、葛根素、黃豆苷、葛根素木糖苷等[2-3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其味甘、辛，涼。歸脾、胃、肺經(jīng)。有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等功效[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛根具有改善心腦血管疾病、降血糖、降血脂、抗腫瘤、解酒等作用，在臨床上可用于治療高血壓、心絞痛、冠心病、偏頭疼、糖尿病、腸道病變等疾病[5-6]。

目前國內(nèi)外對葛根的研究與開發(fā)主要集中在葛根多糖[7]、葛根素[8]、異黃酮類化合物提取[9]等方面，而對其揮發(fā)性化學(xué)成分的研究鮮有報(bào)道。為更好開發(fā)利用葛根，本研究采用頂空固相微萃取的方式，直接萃取葛根樣品中的揮發(fā)性成分，然后利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測分析。與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比，頂空固相微萃取技術(shù)具有簡單便捷、靈敏度高、節(jié)約成本、無需溶劑等優(yōu)點(diǎn)[10]，能夠更加真實(shí)地反映出樣品中的揮發(fā)性成分，在揮發(fā)性物質(zhì)分析中具有顯著優(yōu)勢。由于色譜的分離能力有限，一些結(jié)構(gòu)、極性相似的組分色譜峰會發(fā)生部分或完全重疊，此時(shí)按照常用的NIST譜庫檢索方法無法得到準(zhǔn)確的匹配結(jié)果[11]。而自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）能夠?qū)]發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖進(jìn)行自動(dòng)解卷積處理，可以提取未知組分更“純凈”的質(zhì)譜圖，此時(shí)再通過譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)來匹配化合物[12-13]，使定性結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本研究以葛根為研究對象，采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對其揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，并對其萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用AMDIS和保留指數(shù)對各組分進(jìn)行定性分析。該方法自動(dòng)化程度高、操作簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為葛根的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根干藥材（產(chǎn)自廣西） 中山市中智大藥房連鎖有限公司；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C7～C40） 美國O2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電子電離源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、TRIPLUS RSH自動(dòng)進(jìn)樣器、20 mL頂空樣品瓶、固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣手柄美國Thermo公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取

準(zhǔn)確稱取葛根碎塊3.0 g置于20 mL頂空瓶中（配有聚四氟乙烯墊的螺紋密封蓋），自動(dòng)進(jìn)樣器將頂空瓶放在具有一定溫度的孵化爐中平衡數(shù)分鐘后，將已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分進(jìn)行熱吸附，然后將吸附后的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃條件下進(jìn)行解吸，進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1.0 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持2.0 min；分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為99.999%高純度氦氣；流速1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子能量70 eV；掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～400。

1.3.3 揮發(fā)性成分計(jì)算

在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)中，扣除總離子流圖中的雜質(zhì)和柱流失的峰后，對揮發(fā)性物質(zhì)的峰進(jìn)行積分，再利用軟件導(dǎo)出到Excel表格中，得到各條件下的葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目。

應(yīng)用AMDIS對葛根中揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖自動(dòng)進(jìn)行反卷積處理，所分辨的質(zhì)譜在NIST 2.2標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻(xiàn)已報(bào)道物質(zhì)進(jìn)行核對，只選擇正匹配和反匹配均大于800的物質(zhì)，并用峰面積歸一化法計(jì)算葛根各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

保留指數(shù)是C7～C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)在和葛根樣品相同的分析條件下進(jìn)樣后，AMDIS根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，自動(dòng)計(jì)算出各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

頂空固相微萃取法的萃取效果受萃取時(shí)間、萃取溫度、平衡時(shí)間、解吸時(shí)間、樣品體積等條件的影響[14]，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目為考察指標(biāo)，比較不同萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間對葛根揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響，并確定優(yōu)化參數(shù)。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，稱取葛根碎塊3.0 g，放入20 mL頂空瓶中，并使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在萃取時(shí)間30 min、平衡時(shí)間10 min、解吸時(shí)間5 min的條件下，考察不同萃取溫度（50、60、70、80、90 ℃）的萃取效果，每個(gè)樣品重復(fù)3 次；在確定萃取溫度的基礎(chǔ)上，研究不同平衡時(shí)間（4、7、10、13、16 min）的萃取效果，其余條件不變，每個(gè)樣品重復(fù)3 次；在確定萃取溫度、平衡時(shí)間的基礎(chǔ)上，研究不同萃取時(shí)間（30、40、50、60 min）的萃取效果，其余條件不變，每個(gè)樣品重復(fù)3 次；在最佳條件下，研究不同解吸時(shí)間（3、5、7、9 min）的萃取效果，其余條件不變，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，平衡時(shí)間固定為13 min，選擇萃取溫度、萃取時(shí)間和解吸時(shí)間3 個(gè)影響因素，利用SPSS 19.0設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and coded levels used in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖像處理采用Microsoft Excel軟件完成。根據(jù)1.3.3節(jié)得到各條件下葛根揮發(fā)性組分的總峰面積和峰數(shù)目，計(jì)算各條件下3 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總峰面積，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取溫度對萃取效果的影響

圖1 萃取溫度對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 1 Effect of extraction temperature on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

如圖1所示，隨著萃取溫度的升高，葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目都不斷增加。當(dāng)溫度超過70 ℃時(shí)，總峰面積先急劇升高后緩慢增加；而峰數(shù)目在50～70 ℃時(shí)上升趨勢顯著，超過70 ℃時(shí)，變化不大。這說明，當(dāng)萃取溫度到達(dá)80 ℃時(shí)，葛根中的絕大部分揮發(fā)性物質(zhì)已經(jīng)揮發(fā)出來，并被萃取頭吸附。這是因?yàn)閾]發(fā)性物質(zhì)在低溫條件下?lián)]發(fā)速度慢，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡所需時(shí)間長；而當(dāng)溫度升高時(shí)加快了揮發(fā)性組分的運(yùn)動(dòng)速率，促進(jìn)了萃取頭對目標(biāo)物的富集吸附[15-16]。但是高溫下低沸點(diǎn)組分在與高沸點(diǎn)化合物的競爭吸附中處于劣勢地位，使得部分低沸點(diǎn)化合物流失[17]。另外，高溫還可能使部分揮發(fā)性化合物發(fā)生變性或裂解[16]。綜合考慮，本研究選擇萃取溫度為80 ℃。

2.1.2 平衡時(shí)間對萃取效果的影響

圖2 平衡時(shí)間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 2 Effect of equilibration time on the extraction of volatile compounds from Pueraria Radix

葛根中的揮發(fā)性物質(zhì)在氣相中達(dá)到平衡所需要的時(shí)間即為平衡時(shí)間[18]。如圖2所示，隨著平衡時(shí)間的延長，揮發(fā)性成分的總峰面積先不斷增大后減小，在13 min時(shí)達(dá)到了最大值。當(dāng)延長平衡時(shí)間時(shí)，揮發(fā)性組分的數(shù)目先緩慢增加后略有減少，在13 min時(shí)達(dá)到最高值，總體差異不明顯。由此表明，當(dāng)平衡時(shí)間為13 min時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)在氣相中達(dá)到了較平衡的狀態(tài)，萃取效果穩(wěn)定，有利于萃取頭吸附。所以本研究將平衡時(shí)間設(shè)定為13 min。

2.1.3 萃取時(shí)間對萃取效果的影響

圖3 萃取時(shí)間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

頂空固相微萃取是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，當(dāng)分析物在萃取頭、頂空和樣品3 相中達(dá)到平衡時(shí)的萃取效果最好，所需時(shí)間即為萃取時(shí)間[19]。由圖3可知，隨著萃取時(shí)間的延長，總峰面積呈先增加后降低的趨勢，而峰數(shù)目變化不大。當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，總峰面積和峰數(shù)目均達(dá)到最大值，說明此時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到較平衡狀態(tài)，萃取頭處于飽和吸附狀態(tài)；當(dāng)萃取時(shí)間超過50 min時(shí)，總峰面積和峰數(shù)目均有減小的趨勢，萃取效果降低。這是由于隨著萃取時(shí)間的延長，揮發(fā)性物質(zhì)逐漸在3 相中達(dá)到平衡狀態(tài)，然后被萃取頭吸附。萃取時(shí)間過短時(shí)，揮發(fā)性化合物被吸附不充分；萃取時(shí)間過長時(shí)，已經(jīng)被萃取頭吸附的組分可能逸出，出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，大大降低了萃取效果[20]。綜合考慮，本研究選擇萃取時(shí)間為50 min。

圖4 解吸時(shí)間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 4 Effect of desorption time on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

2.1.4 解吸時(shí)間對萃取效果的影響

在同一解吸溫度下，解吸時(shí)間的長短與揮發(fā)性物質(zhì)從萃取頭固定相中的解吸程度直接相關(guān)。當(dāng)解吸時(shí)間短，揮發(fā)性組分解吸不完全時(shí)，不但影響方法的靈敏度，還會使后續(xù)樣品分析受到污染[21]；反之，當(dāng)解吸時(shí)間過長時(shí)，雖然待測組分能夠完全解吸，但是會導(dǎo)致峰形變寬，高溫下部分組分發(fā)生氧化，并且影響萃取頭的使用

壽命[15-16,22]。從圖4可以看出，隨著解吸時(shí)間的延長，揮發(fā)性組分的總峰面積和峰數(shù)目均呈先增加后減小的趨勢，且在5 min時(shí)均達(dá)到最大值。說明此時(shí)，揮發(fā)性組分已解吸完全，再延長時(shí)間反而會因?yàn)閾p害萃取頭、峰形寬等原因降低萃取效率。因此，本研究選擇解吸時(shí)間為5 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal array experiments

如表2所示，由直接觀察分析可知最佳組合參數(shù)為4號方案即A3B2C2，而從極差結(jié)果來看，當(dāng)以總峰面積作為萃取效果的考察指標(biāo)時(shí)，3 個(gè)因素對萃取效果的影響程度為A＞B＞C，即萃取溫度影響最大，萃取時(shí)間和解吸時(shí)間影響次之，較優(yōu)組合為A3B2C2；當(dāng)以峰數(shù)目為指標(biāo)時(shí)，較優(yōu)組合同樣為A3B2C2，因素主次為A＞B＞C。因此，在本研究中，對于不同的考察指標(biāo)，3 個(gè)因素對萃取效果的影響大小順序相同，均為A＞B＞C，且直接分析與極差分析結(jié)果一致。因此，最終確定頂空固相微萃取法萃取葛根揮發(fā)性成分的較優(yōu)條件為：萃取溫度90 ℃、平衡時(shí)間13 min、萃取時(shí)間50 min、解吸時(shí)間5 min。

2.3 較優(yōu)條件下葛根揮發(fā)性成分分析

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的頂空固相微萃取條件，對葛根揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取并檢測分析，其揮發(fā)性物質(zhì)成分的總離子流圖見圖5，揮發(fā)性組分及相對含量如表3所示。

圖5 葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile compounds in Pueraria Radix

表3 葛根的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components identification from Pueraria Radix

續(xù)表3

由表3可知，在較佳條件下葛根揮發(fā)性成分總離子流圖共分離得到91 種組分，并鑒定出其中67 種成分，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的88.91%，包括烯烴類、醛類、酯類、醇類、酮類及其他類化合物。其中，相對含量最高的為酯類，有11 種，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的26.05%；其次為醛類22 種（22.16%），醇類9 種（13.85%），酮類5 種（5.59%），萜烯類8 種（2.88%）。另外相對含量從高到底排名前10的依次為廣藿香醇（9.72%）、十六酸乙酯（7.63%）、大茴香腦（6.61%）、糠醛（5.93%）、亞油酸乙酯（4.80%）、醋酸（4.28%）、7,10-十八碳二烯酸甲酯（3.70%）、十六酸甲酯（3.64%）、己醛（3.60%）和2-正戊基呋喃（3.58%），占揮發(fā)性成分總量的53.49%。

從表3可以看出，酯類化合物是葛根的主要香氣成分，其中十六酸乙酯的相對含量最高（7.63%），呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣；其次為亞油酸乙酯（4.80%），具有臘腸風(fēng)味。

醛類化合物一般具有良好的風(fēng)味，也是本研究中葛根樣品的主要呈香物質(zhì)。其中，壬醛、己醛、苯甲醛、癸醛、庚醛等化合物具有青草香、花香和水果的甜味[23]；反-2-辛烯醛、正辛醛等呈黃瓜和柑橘樣香氣[24]；而2-甲基丁醛具有獨(dú)特的可可和咖啡香氣[24]。這些酮類物質(zhì)可能來源于氨基酸與葡萄糖發(fā)生降解反應(yīng)所產(chǎn)生。

葛根中的醇類呈香物質(zhì)主要為廣藿香醇（9.72%），具有較淡的廣藿香香氣；而苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣[16]，相對含量為0.37%；1-辛烯-3-醇和α-松油醇分別呈現(xiàn)出蘑菇香味和樟腦氣味[21]，相對含量分別為0.15%和0.09%。

酮類物質(zhì)具有令人愉快的檸檬草香、奶香、果香等氣味，少數(shù)具有油脂氣息[23]。而相對含量較高的醚類化合物大茴香腦（6.61%）具有茴香的特殊氣味，味甜。這些具有風(fēng)味的化合物構(gòu)成了葛根的主要揮發(fā)性成分，對這些芳香物質(zhì)進(jìn)行檢測能夠反映葛根產(chǎn)品的品質(zhì)，并為葛根產(chǎn)品的鑒定和評價(jià)提供參考。

另外本研究檢測到的檸檬烯具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎等生理活性，臨床上可以用于溶解膽結(jié)石、緩解胃灼熱等治療[25]；大茴香腦具有暖胃、健胃、驅(qū)寒、消炎、止痛等作用，還可當(dāng)作增香劑用于糖果、牙膏、飲料等產(chǎn)品中[26]；據(jù)陳曉盈[27]研究報(bào)道β-廣藿香烯具有抗炎、抗急性肺損傷的作用；廣藿香醇具有抗炎、抑制多種真菌無性繁殖的作用[28]；α-松油醇對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌等常見病原菌具有一定的殺滅作用[29]，還具有抗痙攣[30]、抗炎[31]等作用。

本研究鑒定出葛根揮發(fā)性組分與其他文獻(xiàn)報(bào)道有一定差異。李耀華等[32]采用水蒸氣蒸餾法提取四川、湖南、廣西3 個(gè)產(chǎn)地葛根中揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測各產(chǎn)地葛根揮發(fā)油組分，結(jié)果顯示3 個(gè)產(chǎn)地葛根揮發(fā)油分別鑒定出20、24、21 種組分且含量最高的均為亞油酸。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定出的葛根揮發(fā)性成分遠(yuǎn)多于上述文獻(xiàn)報(bào)道，說明該檢測方法和定性分析手段具有顯著的優(yōu)越性。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定頂空固相微萃取法提取葛根揮發(fā)性成分的較佳參數(shù)為：稱取葛根碎塊3.0 g，放入20 mL頂空瓶中，并使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在90 ℃條件下平衡13 min，萃取50 min，最后在進(jìn)樣口解吸5 min。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對較佳條件下萃取的葛根揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測，并利用AMDIS和保留指數(shù)對其組分進(jìn)行定性分析，最終鑒定出67 種化合物。其中，相對含量最高的為酯類（26.05%），其次為醛類（22.16%）、醇類（13.85%）、酮類（5.59%）、萜烯類（2.88%）等，對這些揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測能夠反映葛根產(chǎn)品的品質(zhì)。該方法自動(dòng)化程度高、操作簡單、定性更加準(zhǔn)確、結(jié)果更加可靠，為葛根品質(zhì)的鑒定和評價(jià)提供了有力支持，也為葛根產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。該方法也可以應(yīng)用到其他藥食同源植物揮發(fā)性成分檢測分析中，為控制藥食同源產(chǎn)品質(zhì)量，促進(jìn)藥食同源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了科學(xué)支持。