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        靈芝中17 種農(nóng)藥的QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測(cè)技術(shù)

        2019-07-05 02:13:32崔麗麗閆梅霞逄世峰周春元王英平
        食品科學(xué) 2019年12期
        關(guān)鍵詞:靈芝純度凈化

        崔麗麗,閆梅霞,逄世峰,周春元,王英平*

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130112)

        靈芝屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬,是一種非常名貴的食藥用大型真菌,具有重要經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值,在我國(guó)應(yīng)用已有2 000多年的歷史。全世界已報(bào)道種類200余種[1],中國(guó)藥典中收錄入藥為赤芝(Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.))或紫芝(Ganoderma sinense Zhao(Xu et Zhang))干燥子實(shí)體[2]。在我國(guó)東北地區(qū)靈芝種類分布減少,松杉靈芝(Ganoderma tsugae)是東北地區(qū)最常見(jiàn)種類[1]。隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展,靈芝需求量增加。目前,栽培靈芝逐漸成為靈芝的主要來(lái)源。靈芝的栽培方式有袋料栽培、段木栽培、仿野生林下栽培等[3]。靈芝在制種期和栽培期有多種病菌和雜菌導(dǎo)致病害發(fā)生,侵染性病害主要為青霉菌污染率高達(dá)80%~90%,靈芝害蟲也多達(dá)16 種[4-12]。為降低病蟲害穩(wěn)定產(chǎn)量提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值,藥劑防治是必要措施之一。引起食用菌農(nóng)藥殘留的因素有病蟲害防治過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的使用,也有水土中殘留農(nóng)藥的污染,或是栽培料中殘留[13-17]。目前主要研究集中于靈芝栽培技術(shù)和有效成分研究,在農(nóng)藥檢測(cè)上報(bào)道有限。隨著國(guó)際貿(mào)易增加和對(duì)食品安全關(guān)注,重金屬和農(nóng)藥殘留已成為必檢項(xiàng)目,GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定我國(guó)食用菌農(nóng)藥殘留指標(biāo)有21 項(xiàng),涉及26 種農(nóng)藥,其中有19 項(xiàng)為最大殘留限量,有2 項(xiàng)為臨時(shí)限量[18]。我國(guó)是世界食用菌產(chǎn)量大國(guó),我國(guó)食藥用菌類產(chǎn)品出口美國(guó)、日本、韓國(guó)和歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家地區(qū),由于生產(chǎn)方式和標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)差異等原因,食藥用菌出口貿(mào)易原因受到扣留或召回,2011—2016年被召回或扣留595 批次,其中農(nóng)殘超標(biāo)引起的有219 批次,占37%[19-20]。而且已有研究發(fā)現(xiàn)靈芝等食用菌對(duì)農(nóng)藥具有富集性[21-23],農(nóng)藥檢測(cè)結(jié)果極易存在假陰性。因此,加強(qiáng)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法和農(nóng)藥合理使用技術(shù)研究,這不僅有利于食用菌產(chǎn)品的出口貿(mào)易,更關(guān)乎我國(guó)的食品安全和環(huán)境保護(hù)。

        食用菌農(nóng)藥提取凈化的前處理方法常見(jiàn)的有均質(zhì)提取、超聲提取、加速溶劑萃取、固相萃取凈化、凝膠滲透色譜凈化及QuEChERS技術(shù),常用分析技術(shù)有氣相色譜法、高效液相色譜法及串聯(lián)質(zhì)譜法[24]。靈芝的農(nóng)藥殘留限量和檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有明確的規(guī)定,已報(bào)道相關(guān)研究:陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取、凝膠滲透色譜凈化、氣相色譜法測(cè)定靈芝中24 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留,王懷豫等[26]用中國(guó)藥典方法檢測(cè)靈芝中有機(jī)氯類農(nóng)藥,劉志風(fēng)等[27]采用高速分散提取、弗羅里硅土層析柱石油醚洗脫凈化、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用法檢測(cè)15 種農(nóng)藥。QuEChERS是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的AOAC官方方法和英國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法EN 15662-2008[28-29],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在蔬果[30]、食用菌[31]及中草藥[32]等各類食品藥品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中。本研究利用QuEChERS方法原理建立集萃取和凈化為一體的新型前處理方法,結(jié)合GC-MS檢測(cè)系統(tǒng),用于靈芝中農(nóng)藥多種殘留快速提取檢測(cè),不僅能夠有效縮短前處理時(shí)間,提高檢測(cè)效率,而且有機(jī)溶劑用量顯著降低,使得農(nóng)殘分析更環(huán)保,保障了檢測(cè)人員身體健康。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        供試樣品靈芝子實(shí)體由延邊大陽(yáng)參業(yè)有限公司提供,經(jīng)過(guò)自然干燥后取不少于200 g試樣,置于高速粉碎機(jī)中粉碎、混勻,裝入聚乙烯塑料袋中保存。

        乙腈、丙酮、正己烷(均為色譜純) 美國(guó)Fisher公司;水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水;0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜、凈化試劑盒64501、64504、64512(N-丙基乙二胺(primary secondaryamine,PSA))、MgSO4、C18填料) 北京迪馬科技有限公司。

        農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):α-六六六(C6H6Cl6,純度99.5%,CAS No.319-84-6),β-六六六(C6H6Cl6,純度99.5%,CAS No.319-85-7),γ-六六六(C6H6Cl6,純度99.5%,CAS No.58-89-9),δ-六六六(C6H6Cl6,純度98.1%,CAS No.319-84-6),六氯苯(C6Cl6,純度99.5%,CAS No.118-74-1),p,p’-DDD(C14H10Cl4,純度98.1%,CAS No.72-54-8),o,p’-DDT(C14H9Cl54,純度99.5%,CAS No.789-02-6),p,p’-DDT(C14H9Cl5,純度98.9%,CAS No.50-29-3),p,p’-DDE(C14H8Cl4,純度99.5%,CAS No.72-55-9),嘧菌環(huán)胺(C14H15N3,純度100%,CAS No.121552-61-2),腐霉利(C13H11Cl2NO2,純度100%,CAS No.32809-16-8),五氯硝基苯(C6Cl5NO2,純度99.5%,CAS No.82-68-8),二嗪磷(C12H21N2O3PS,純度100%,CAS No.333-41-5),醚菌酯(C18H19NO4,純度99%,CAS No.143390-89-0),異菌脲(C13H13Cl2N3O3,純度98.6%,CAS No.36734-19-7),丙環(huán)唑(C18H19NO4,純度99.5%,CAS No.60207-90-1),嘧菌酯(C22H17N3O5,純度99.5%,CAS No.131860-33-8),乙霉威(C14H21NO4,純度99.5%,CAS No.87130-20-9),苯醚甲環(huán)唑(C19H17Cl2N3O3,純度99.5%,CAS No.119446-68-3),甲霜靈(C15H2NO4,純度99.5%,CAS No.57837-19-11)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;天平(感量為0.001 g和0.000 1 g) 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;TGL-16M高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司;T25均質(zhì)器德國(guó)IKA公司;Vortex-Genie渦旋混合器 美國(guó)Scientific Industries公司。

        1.3 方法

        1.3.1 色譜條件

        色譜柱:HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)或相當(dāng)者;程序升溫:初始柱溫120 ℃保持1 min,10 ℃/min升到260 ℃,保持10 min;載氣為氦氣(純度≥99.999%),流速1.0 mL/min,尾吹氣流量20 mL/min,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為1 μL。

        1.3.2 質(zhì)譜條件

        電子電離源;電子能量70 eV;進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測(cè)器溫度280 ℃,離子源溫度200 ℃;單離子掃描模式(single ion monitoring,SIM);溶劑延遲時(shí)間10 min。

        1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        精密稱取50 mg各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)丙酮溶解配制成質(zhì)量濃度500 μg/mL儲(chǔ)備液,貯存于-20 ℃。

        精密吸取適量的儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中正己烷定容,配成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.3.4 樣品液制備

        稱取粉碎均勻試樣1.0 g(精確到1 mg),加入10 mL純水浸泡30 min,加入20 mL乙腈,高速勻漿均質(zhì)提取2 min(10 000 r/min),加入6 g NaCl高速渦旋振蕩混勻1 min,以5 000 r/min離心5 min,取上清液4 mL,加入含有150 mg PSA、900 mg MgSO4凈化包(No.64504),高速渦旋1 min混勻,以5 000 r/min離心5 min,取上清液上機(jī)檢測(cè)。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        通過(guò)色譜分析儀器GC-MS獲得數(shù)據(jù)使用Excel 2006進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜質(zhì)譜條件確定

        選擇對(duì)弱極性化合物分離較好的毛細(xì)管柱色譜柱HP-5,通過(guò)Scan模式掃描,確定農(nóng)藥的保留時(shí)間,選擇定性定量離子,建立SIM離子監(jiān)測(cè)方法,每種農(nóng)藥選擇一個(gè)定量離子,2 個(gè)定性離子,按照保留時(shí)間順序分段檢測(cè)。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間及定量、定性離子見(jiàn)表1。

        表1 農(nóng)藥的質(zhì)量分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for pesticides

        續(xù)表1

        2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化2.2.1 提取條件確定

        表2 靈芝樣品不同前處理的回收率Table 2 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different pretreatments

        QuEChERS法中常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等,乙腈因其最適宜于萃取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥,且萃出物中雜質(zhì)含量較低[33],因此是目前使用最廣泛的提取溶劑。根據(jù)農(nóng)藥的溶解性和穩(wěn)定性,同時(shí)參照EN15662[28]和AOAC[29]的QuEChERS方法,也選擇乙腈作為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)提取方法主要考察振蕩提取和高速均質(zhì)提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分農(nóng)藥均質(zhì)提取效果好于振蕩提取。前處理包括提取和凈化兩個(gè)步驟,實(shí)驗(yàn)中加入萃取鹽包(4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g TSCD和0.5 g DHS)和凈化包64507,但是添加回收率很低,分析可能原因:一是加入萃取鹽產(chǎn)生大量熱量造成熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解,二是凈化包64507中含有C18,C18主要用于去除非極性雜質(zhì)效果良好[34],然而有機(jī)氯農(nóng)藥正是屬于非極性較強(qiáng)的化合物,因此C18吸附對(duì)回收率產(chǎn)生很大影響。均質(zhì)提取時(shí)改加氯化鈉促進(jìn)分層,凈化使用不含C18的64501,半數(shù)農(nóng)藥回收率提高至70%~120%范圍內(nèi)(表2),由此可見(jiàn)在靈芝中農(nóng)藥檢測(cè)前處理時(shí)盡量減少對(duì)農(nóng)藥的分解和吸附,靈芝本身對(duì)農(nóng)藥和重金屬的富集特性[15-16],極易導(dǎo)致農(nóng)藥提取不充分而影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

        2.2.2 凈化條件篩選

        2.2.2.1 凈化劑篩選

        QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、十八烷基硅烷(C18)、石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)、無(wú)水MgSO4等[35]。農(nóng)殘檢測(cè)時(shí)凈化效果極大地影響檢測(cè)儀器和檢測(cè)結(jié)果,考察64501、64504、64512和64565四種凈化試劑盒的凈化效果(圖1)。隨著PSA和MgSO4量提高,如有機(jī)氯類α-六六六、β/γ-六六六、δ-六六六、p,p’-DDT、腐霉利、五氯硝基苯等多數(shù)農(nóng)藥的回收率明顯提高,而含有Carb和C18會(huì)吸附部分農(nóng)藥導(dǎo)致收率有所降低。本實(shí)驗(yàn)選擇凈化試劑盒64504作凈化劑,回收率相對(duì)較高,在農(nóng)殘檢測(cè)規(guī)定的70%~120%之間農(nóng)藥17 種,異菌脲、乙霉威和苯醚甲環(huán)唑的回收率高于120%,分析原因可能是靈芝的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)所致,可以采用靈芝基質(zhì)液配制農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液。

        圖1 不同凈化試劑盒處理后靈芝中農(nóng)藥回收率Fig. 1 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different purification kits

        2.2.2.2 提取液凈化體積篩選

        固定量的凈化劑對(duì)不同體積提取液的凈化效果不同,因此要確定提取液的最佳上樣凈化體積,比較2、4、8 mL提取液上樣凈化效果。按照設(shè)想體積越小凈化效果越好,農(nóng)藥回收率也高,然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明隨著凈化的提取液體積增加大部分農(nóng)藥回收率增加,但是凈化后溶液顏色隨上樣體積增加而加深,說(shuō)明凈化劑的含量雖然能保證凈化效果,對(duì)儀器的污染也在增加。因此本實(shí)驗(yàn)選擇吸取4 mL提取液凈化,既能夠保證凈化效果,又最大程度地降低對(duì)儀器污染。

        圖2 不同凈化液體積對(duì)靈芝中農(nóng)藥回收率影響Fig. 2 Recoveries of pesticides from Ganoderma tsugae with different volumes of extract sample

        2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

        2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

        表3 17 種農(nóng)藥線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Calibration equations, linearity ranges and correlation coefficients for 17 pesticides

        分別精密吸取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液,按選定的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)試,經(jīng)選擇離子定量掃描,以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得各農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以定量離子信噪比RSN為3為樣品檢出限,RSN為10為定量限。表3表明,17 種殺菌劑線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.98,方法檢出限在0.002~0.022 mg/kg之間,定量限在0.007~0.072 mg/kg之間。

        2.3.2 儀器精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使之添加量為0.5 mg/kg的靈芝樣品,經(jīng)過(guò)前處理后,GC-MS上樣,每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)試5 針,提取定量離子獲得每種農(nóng)藥的峰面積,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,實(shí)驗(yàn)設(shè)置2 個(gè)平行。結(jié)果表明儀器精密度良好,90%農(nóng)藥相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)在1.06%~7.53%之間,嘧菌酯、丙環(huán)唑稍高,在10.26%~19.70%之間(圖3)。

        圖3 GC-MS儀器精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Results of instrumental precision of GC-MS

        2.3.3 方法的準(zhǔn)確性

        表4 松杉靈芝中農(nóng)藥的添加回收率和RSD(n= 3)Table 4 Recoveries and RSDs of pesticides from spiked G. tsugae (n= 3)

        樣品中準(zhǔn)確加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使添加量分別為0.05、0.1、0.5 mg/kg,按最優(yōu)條件進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)添加實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個(gè)平行和1 個(gè)對(duì)照,計(jì)算加標(biāo)平均回收率和3 次測(cè)定的RSD。結(jié)果(表4)表明方法準(zhǔn)確可行,17 種農(nóng)藥回收率范圍在71.10%~119.55%,RSD范圍為0.47%~20.05%。陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取靈芝中二嗪磷平均回收率86%,而本實(shí)驗(yàn)建立的QuEChERS-GCMS方法二嗪磷平均回收率為94.04%。

        3 結(jié)論與討論

        QuEChERS法是基于基質(zhì)固相分散而開發(fā)的,主要包括以下步驟:1)待測(cè)樣品的粉碎和均質(zhì)處理。2)待測(cè)組分的提?。菏褂糜袡C(jī)溶劑和水的混合溶劑溶解樣品中的待測(cè)組分,并通過(guò)液液分配使待測(cè)組分集中于上層有機(jī)溶劑中。3)待測(cè)樣品的凈化:通過(guò)添加凈化劑去除待測(cè)樣品中的脂肪酸、色素、糖類等雜質(zhì)。靈芝子實(shí)體因木質(zhì)化程度高,使用中藥粉碎機(jī)粉碎后成絮狀,有研究表明普通粉碎靈芝多糖等有效成分提取效率低[36]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)勻漿機(jī)刀頭上萬(wàn)轉(zhuǎn)的高速旋轉(zhuǎn)進(jìn)行均質(zhì),充分粉碎木質(zhì)化的靈芝子實(shí)體的組織和細(xì)胞使待測(cè)組分在樣品中的分布更均勻,同時(shí)提取時(shí)加入鹽析劑NaCl,調(diào)節(jié)極性、減少極性雜質(zhì)的干擾,利于乙腈對(duì)農(nóng)藥的充分提取,并促進(jìn)液液分配。

        常規(guī)農(nóng)殘檢測(cè)方法索氏提取、磺化法凈化中國(guó)藥典規(guī)定方法超聲波提取、溶劑萃取凈化相比,索氏提取的提取效率高于藥典超聲法[37],但索氏提取熱回流耗時(shí)較長(zhǎng)一般需要數(shù)小時(shí)[38]。本研究采用改進(jìn)的QuChERS方法提取和凈化樣品,利用GC-MS的SIM模式快速檢測(cè)靈芝中農(nóng)藥多殘留,操作簡(jiǎn)單、檢出限低。該方法的平均回收率為71.10%~119.55%,RSD基本小于20%,完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求,且在40 min內(nèi)即可完成17 種農(nóng)藥多殘留分析,整個(gè)檢測(cè)只需20 mL乙腈,具有快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),極大地提高了檢測(cè)效率,也減少了對(duì)環(huán)境的污染,保障了檢驗(yàn)人員的健康。但最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是預(yù)建立六六六、DDT、五氯硝基苯、甲霜靈、嘧菌酯、嘧菌環(huán)胺等20 種農(nóng)藥多殘留同時(shí)檢測(cè)方法,但在實(shí)驗(yàn)中異菌脲、苯醚甲環(huán)唑和乙霉威3 種農(nóng)藥的添加回收率高于120%,分析原因可能與靈芝基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。課題組擬開展靈芝基質(zhì)效應(yīng)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中影響研究。

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