羅 煜，劉薇叢，郭薇丹，付湘晉*，徐莉娜，胡作民，李正雯，徐友志

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

食品加工過程中，酵母經(jīng)常耐受低溫脅迫[1]，如冷凍面團(tuán)加工、啤酒釀造、葡萄酒釀造。冷脅迫改變酵母的代謝途徑及代謝物組成，對酵母發(fā)酵食品品質(zhì)有重要影響。目前研究較多的是面包酵母、釀酒酵母，冷脅迫相關(guān)的代謝物有海藻糖[2-5]、脯氨酸[6-8]、甘油[9-12]、精氨酸、谷氨酸[13]、脂類[14]等。如Shi Xiaojian等[9]發(fā)現(xiàn)，冷脅迫時，面包酵母細(xì)胞內(nèi)部海藻糖、甘油和氨基酸的含量大幅度增加。Sasano等[7]研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸在短期冷凍時間內(nèi)可對面包酵母發(fā)揮保護(hù)作用。耐凍面包酵母突變體可以在細(xì)胞內(nèi)積累大量的脯氨酸，使其在冷凍脅迫條件下比親本野生菌活性更強(qiáng)[8]。Murakami等[15]研究表明面包酵母細(xì)胞膜上固醇-磷脂比低具有更好的抗凍性。Blagovi?等[16]通過將面包酵母在4 ℃和－20 ℃培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)組成的改變可以增加其抗凍性。Petrujki?等[17]對酵母菌株的冷脅迫進(jìn)行研究，結(jié)果表明在低溫下，中鏈脂肪酸和和三酰甘油酯的含量增加，而磷脂酸含量和磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的比率降低。López-Malo等[18]通過加強(qiáng)葡萄酒酵母脂質(zhì)基因的表達(dá)增強(qiáng)了低溫下酵母的發(fā)酵能力。López-Malo等[19]比較12 ℃和28 ℃條件下釀酒酵母的代謝圖譜，發(fā)現(xiàn)氨基酸和脂質(zhì)類物質(zhì)有巨大差異。

近年來，一些非傳統(tǒng)釀造用酵母受到關(guān)注，如Ca?as等[20]發(fā)現(xiàn)，異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）可改善葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)。Ye等[21]發(fā)現(xiàn)，W. anomalus可改善蘋果酒品質(zhì)。非釀酒酵母比釀酒酵母更耐受低溫脅迫，非釀酒酵母在低溫下的代謝產(chǎn)物酯、高級醇、甘油、醛、酸等對酵母發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用[22-23]。

本實驗室從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選到6 株耐凍酵母，全部鑒定為W. anomalus。采用代謝物組學(xué)方法研究這6 株W. anomalus在冷脅迫過程中代謝物組的變化，識別冷脅迫標(biāo)志性代謝物，為酵母發(fā)酵食品品質(zhì)調(diào)控及酵母冷脅迫機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異常威克漢姆酵母（W. anomalus）共6 株（J7、J8、J9、J12、J18、J25），保藏于中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基，120 ℃高壓滅菌20 min。取出后冷卻待用。制作固體培養(yǎng)基時，添加瓊脂20.0 g/L。

核糖醇、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）（含1%三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMS））、甲氧胺鹽酸鹽、吡啶（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、Rtx-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.32 μm，0.25 μm） 日本島津公司；TY2002電子天平 上海浦春計量儀器股份有限公司；BCD-206-TASJ X低溫冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母細(xì)胞液的制備、冷脅迫處理

將斜面培養(yǎng)基中已純化冷凍保存6 株W. anomalus酵母菌株（分別編號為J7、J8、J9、J12、J18、J25）接種至20 mL察氏液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min活化18 h。將活化后的酵母接種至100 mL察氏培養(yǎng)液中，接種量5%，28 ℃靜置培養(yǎng)18 h，再于4 ℃冰箱中分別冷脅迫處理24、48、72 h。取菌液10 000×g離心15 min，常溫樣品常溫離心，冷脅迫樣品4 ℃離心，取上清液0.5 mL，加入50 μL的核糖醇溶液（20 g/L），渦旋混勻，真空冷凍干燥24 h。

1.3.2 衍生化

參考李玉冬等[24]的實驗方法。凍干樣品中加入 80 μL 20 mg/mL甲氧胺鹽酸的吡啶溶液，渦旋30 s使其混合均勻，于70 ℃反應(yīng)90 min，使樣品充分肟化。加入80 μL的BSTFA（含1%TMS）衍生試劑，渦旋30 s使其混合均勻，于70 ℃反應(yīng)90 min進(jìn)行衍生化反應(yīng)。取出離心管，冷卻至室溫，加1 mL己烷，渦旋30 s使其混合均勻，冷凍離心，取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS條件

進(jìn)樣量0.5 μL，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，分流比為10∶1，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。氣相色譜條件：程序升溫：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升溫至160 ℃，以1 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至255 ℃，再以1 ℃/min升至278 ℃，再持續(xù)3 min；質(zhì)譜條件：電離方式電子電離源，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～400 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

代謝物定性：利用計算機(jī)檢索得到的成分并與NIST05質(zhì)譜庫所提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對照，選取匹配度高于80%的物質(zhì)，確定物質(zhì)名稱。

代謝物定量：同一樣品重復(fù)3 次，選取峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%的2 次實驗結(jié)果，取平均值作為代謝物的峰面積；以代謝物與內(nèi)標(biāo)核糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積百分比作為代謝物相對峰面積。

差異代謝物識別：采用SIMCA-13.0軟件（Umetrics，瑞典）對冷脅迫不同時間酵母的代謝物峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLSDA），并采用SPSS 18.0（IBM，美國）進(jìn)行t檢驗；OPLS-DA中VIP值大于1.0且t檢驗中P值小于0.05的物質(zhì)識別為標(biāo)志性代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物組成分析

圖1 W. anomalusJ8代謝物組GC-MS圖Fig. 1 GC-MS chromatogram of metabolites of W. anomalus J8

表1 酵母W. anomalus代謝物組Table 1 Metabolites of W. anomalus with cold treatment

酵母W. anomalus代謝物組GC-MS測定結(jié)果見圖1、表1，共鑒定到133 種代謝物，其中質(zhì)量濃度超過10 mg/L（以核糖醇為內(nèi)標(biāo)）的代謝物49 種。糖、糖醇、糖酸31 種，糖苷3 種，酸6 種，醇3 種，酯4 種，萜類2 種。雖然培養(yǎng)基中只添加了蔗糖，但經(jīng)過W. anomalus代謝后，可檢測到34 種糖、糖醇、糖酸、糖苷類，這反映了W. anomalus強(qiáng)大復(fù)雜的糖代謝能力。其中，L-(＋)-蘇糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露二糖、木糖醇、赤蘚糖醇等具有益生元活性，阿洛糖具有抗癌活性；赤蘚糖醇是糖尿病人、心血管病人和肥胖病人飲食中理想的甜味劑，阿洛酮糖還具有減少體脂肪的活性[25]。糖類代謝的變化還可能對口感有重要影響，如赤蘚糖醇甜度為蔗糖的70%～80%，果糖是糖類中最甜的糖。

此外，還合成角鯊烯、百里香酚-β-D-葡萄糖苷、β-羥基-苯丙酸、異長葉烯、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯。這幾種物質(zhì)均具有顯著的抗氧化活性，可能與酵母冷脅迫時氧化應(yīng)激有關(guān)，也表明這幾株W. anomalus具有抗氧化活性。百里香酚還具有高效的抑菌活性。角鯊烯具有多種保健活性，所以，本研究W. anomalus可能可用于加工具有一定保健功效的食品。角鯊烯、百里香酚、異長葉烯均屬于萜類化合物，表明W. anomalus細(xì)胞中萜類代謝活性較高，有報道利用酵母生產(chǎn)角鯊烯、胡蘿卜素、番茄紅素等萜類化合物[26]，但百里香酚、異長葉烯鮮見報道。β-羥基-苯丙酸屬于苯丙素類（苯丙素類包括阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸等），表明W. anomalus酵母中存在苯丙素類化合物代謝途徑。

2.2 差異代謝物識別

圖2 OPLS-DA得分圖Fig. 2 Score plots of OPLS-DA

進(jìn)一步采用OPLS-DA、t檢驗分析上述49 種代謝物峰面積數(shù)據(jù)，識別差異代謝物。從圖2可以看出，OPLSDA模型可以對冷脅迫酵母發(fā)酵液進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，且模型預(yù)測性非常強(qiáng)（Q2＞0.5）。以O(shè)PLS-DA分析中VIP值大于1.0且t檢驗中P值小于0.05的物質(zhì)為冷脅迫標(biāo)志性代謝物，結(jié)果見表2、圖3。

表2 W. anomalus冷脅迫標(biāo)志性差異代謝物Table 2 Differential metabolites as biomarkers of W. anomalus under cold stress

冷脅迫24 h相較于0 h，識別的差異代謝物有：百里香酚-β-D-葡萄糖苷、甘油、蔗糖、赤蘚糖醇、角鯊烯。冷脅迫48 h時，識別的差異代謝物有：半乳糖、蔗糖、赤蘚糖醇、角鯊烯。冷脅迫72 h時，識別的差異代謝物有：半乳糖、蔗糖、甘露糖、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、赤蘚糖醇、角鯊烯。

圖3 冷脅迫時間對差異代謝物含量的影響Fig. 3 Effect of cold stress duration on contents of marker metabolites

如圖3a所示，蔗糖是察氏培養(yǎng)基中的碳源，在W. anomalus酵母生長過程中被消耗，所以一直減少，也說明在低溫狀態(tài)下，酵母依然在進(jìn)行代謝。甘油是酵母細(xì)胞中的重要相容性物質(zhì)，與酵母抗凍性、抗高滲透性有關(guān)；還可以平衡細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD的比值，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，有利于在應(yīng)激下保護(hù)酵母細(xì)胞。圖3c表明，隨著冷脅迫時間的延長，甘油含量在冷脅迫24 h時達(dá)到最高，之后隨著時間的延長而減小，與文獻(xiàn)報道一致。4 ℃冷脅迫處理，蛋白酪氨酸激酶途徑的激活，促進(jìn)甘油的合成和積累[12]；在4 ℃冷脅迫24 h時，甘油含量明顯增加[27]，而在發(fā)酵后期，甘油會逐漸被分解[28]。

半乳糖、角鯊烯、赤蘚糖醇、甘露糖、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、百里香酚-β-D-葡萄糖苷是本研究新發(fā)現(xiàn)的W. anomalus酵母冷脅迫特征性代謝物。在冷脅迫條件下，角鯊烯的含量顯著增加（圖3h）。角鯊烯屬于類異戊二烯，是合成甾醇、類固醇和泛醌的前體物質(zhì)。角鯊烯在合成后會繼續(xù)參與麥角固醇的合成，然而該過程需要大量的氧氣參與才能進(jìn)行。冷脅迫時，溫度降低，菌液中的氧氣含量降低，該環(huán)境有利于角鯊烯的積累[29]。Blagovi?等[30]也有類似結(jié)果，在厭氧條件下，得到高含量的角鯊烯。相應(yīng)的，麥角固醇的含量降低，而酵母菌株在固醇含量低時有更好的抗凍效果。此外，角鯊烯作為一種非極性的脂質(zhì)存在于細(xì)胞膜中，當(dāng)受到外界脅迫時，角鯊烯的積累也有助于保護(hù)細(xì)胞膜，從而減少傷害。赤蘚糖醇也是酵母細(xì)胞中的重要相容性物質(zhì)，在高滲脅迫中對酵母細(xì)胞有確切保護(hù)作用；圖3表明，赤蘚糖醇在冷脅迫過程中顯著增加，酵母耐高滲脅迫和耐冷脅迫可能具有相近機(jī)制。半乳糖含量在酵母冷脅迫48 h后顯著增加（P＜0.05）（圖3f），是冷脅迫相關(guān)代謝物，但其累積機(jī)制未知。同樣，W. anomalus在冷脅迫中甘露糖、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸的含量降低的機(jī)制也還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

采用衍生化GC-MS技術(shù)測定冷脅迫處理（4 ℃）對6 株W. anomalus代謝物組的影響。含量超過10 mg/L（以核糖醇為內(nèi)標(biāo)）的代謝物49 種，糖、糖醇、糖酸31 種，糖苷3 種，酸6 種，醇3 種，酯4 種，萜類2 種，反映了W. anomalus復(fù)雜的糖代謝能力，且含大量具有生理活性的糖類，W. anomalus可用于加工具有一定保健功效的食品。W. anomalus具有萜類、苯丙素物質(zhì)代謝途徑。甘油、角鯊烯、赤蘚糖醇、半乳糖、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、甘露糖、百里香酚-β-D-葡萄糖苷可能是W. anomalus冷脅迫相關(guān)的特征性代謝物，但其代謝機(jī)制也還需要進(jìn)一步研究。